La necesidad de terapias hepáticas innovadoras.

La insuficiencia hepática como consecuencia de una enfermedad hepática crónica progresiva o aguda representa una situación potencialmente mortal que puede conducir a un coma hepático y finalmente a la muerte si no se trata adecuadamente. Las terapias convencionales disponibles, aunque a menudo son beneficiosas para el alivio de los síntomas clínicos, no son eficaces en el tratamiento causal de la enfermedad hepática aguda sobre crónica o aguda. Por tanto, hasta la fecha, la única terapia eficaz de la insuficiencia hepática terminal es el trasplante de hígado. La introducción del trasplante de hígado como opción terapéutica ha reducido significativamente la mortalidad de los pacientes con insuficiencia hepática aguda. Los avances logrados en las últimas décadas en técnicas quirúrgicas, cuidados intensivos, régimen inmunosupresor y métodos de conservación de órganos han hecho del trasplante de hígado una forma de terapia bien establecida y exitosa. 

Sin embargo, la escasez existente de órganos de donantes disponibles no permite una expansión significativa de los programas de trasplante, y el número de pacientes en lista de espera para trasplante supera ampliamente el número de órganos de donantes disponibles para trasplante. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar terapias alternativas o complementarias al trasplante de hígado. Se pueden concebir dos enfoques terapéuticos principales: soporte hepático temporal para unir la función del órgano hasta el trasplante o hasta la regeneración del propio hígado o curación permanente del órgano mediante trasplante de células para reparar el tejido dañado.

Requisitos de los sistemas de soporte hepático.

Para proporcionar un soporte temporal exitoso del órgano defectuoso en la enfermedad hepática en etapa terminal, se deben tener en cuenta las complejas funciones metabólicas de las células hepáticas. Las funciones principales del hígado son (i) transformación de metabolitos endógenos (p. Ej., Amoníaco) o componentes tóxicos exógenos (p. Ej., Fármacos, productos químicos) en metabolitos no tóxicos, (ii) regulación de moléculas pequeñas, en particular aminoácidos, carbohidratos y grasas ácidos, y (iii) la síntesis de proteínas como la albúmina o factores de coagulación que son liberados por el hígado a la sangre. Las alteraciones en una de varias de estas funciones pueden provocar acumulación de toxinas, desequilibrios en compuestos plasmáticos, por ejemplo, aminoácidos libres y / o hipoproteinemia, con consecuencias perjudiciales para el paciente. Por lo tanto, un sistema de soporte hepático ideal cumpliría todas las tareas principales del hígado humano en términos de desintoxicación, regulación y síntesis hepática.

Además de la funcionalidad y eficacia de los sistemas de soporte hepático, deben tenerse en cuenta cuestiones de seguridad. En particular, los sistemas utilizados para apoyar la función hepática en el hígado enfermo deben ser estables durante el período de tratamiento y mostrar funciones reproducibles para garantizar una calidad estandarizada. Además, se exige la investigación de la biocompatibilidad de los materiales utilizados y la prevención de la infección de los pacientes para garantizar la seguridad clínica de los tratamientos.

Sistemas de soporte hepático artificial

Los sistemas de soporte hepático artificial están destinados a eliminar las toxinas de la sangre de los pacientes con insuficiencia hepática mediante técnicas de adsorción mecánicas y / o químicas. Para proporcionar una desintoxicación eficaz, la mayoría de estos sistemas se basan en la desintoxicación del plasma del paciente con adsorbentes, tipo diálisis, utilizando carbón activado suspendido en el dializado para la adsorción de toxinas, o albúmina proporcionada en el líquido de diálisis como eliminador fisiológico de compuestos lipofílicos. El sistema de recirculación de adsorbente molecular combina la diálisis de albúmina con una columna de intercambio aniónico y de carbón, que permite el reciclaje de las moléculas de albúmina después de pasar por la columna de adsorbente. Se demostró que el sistema proporciona una eliminación eficaz de las toxinas plasmáticas del plasma en estudios preclínicos y clínicos. Se persigue un enfoque diferente en el dispositivo de desintoxicación de separación y adsorción de plasma fraccionado (FPSA), también conocido como sistema Prometheus, que conduce directamente el plasma a través de columnas adsorbentes sólidas para facilitar la eliminación de toxinas.

Se han publicado los resultados de varios ensayos clínicos aleatorizados de sistemas de apoyo artificial. El efecto sobre la insuficiencia hepática aguda de la diálisis con albúmina se investigó en un ensayo que incluyó a 49 pacientes tratados convencionalmente y 39 con terapia de diálisis con albúmina. Aunque se observó una tendencia hacia tasas de supervivencia más altas, no fue posible sacar conclusiones definitivas sobre la eficacia o seguridad del sistema. Estos resultados sugieren que la desintoxicación físico-química del plasma por sí sola no es suficiente para abordar la función hepática de manera que aumente la probabilidad de supervivencia. La cuestión de si la calidad de vida de los pacientes con enfermedad hepática aguda o aguda sobre crónica puede mejorarse mediante sistemas de soporte hepático artificial sigue abierta.

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Biorreactores de tanque de acero inoxidable

Con la necesidad de desarrollar procesos que cumplan con las normativas, es cada vez más claro dentro de la industria de la terapia celular que los biorreactores agitados de tanques de acero inoxidable tradicionales se están pasando por alto en favor de los biorreactores de tanque agitado (SUB) de un solo uso, un tendencia alineada con la producción biofarmacéutica tradicional. Este interruptor alivia la carga reglamentaria de tener que validar los procedimientos de limpieza y esterilización y evita los grandes costos de capital e infraestructura asociados con los biorreactores de tanque agitado de acero inoxidable y su mantenimiento. También simplifica el proceso al reducir el tiempo y el costo asociados con los procedimientos de instalación y eliminación de desechos. Sin embargo, este enfoque tiene sus inconvenientes con respecto a los costos continuos de los SUB y, quizás lo que es más preocupante, la dependencia de un solo proveedor para un aspecto clave del proceso. Esta limitación tiene implicaciones con respecto tanto a la fiabilidad del suministro como a la calidad de los SUB. Cualquier problema que encuentre el proveedor con respecto al suministro de SUB, por defecto, se convierte en un problema para la empresa de terapia celular. De manera similar, será necesario una supervisión y validación estrictas para garantizar que la calidad dispositivos suministrados sea constante, ya que cualquier variación en la calidad de construcción puede tener un impacto directo en el proceso de terapia celular. Otro problema podría ser la capacidad de utilizar el protocolo de recolección descrito anteriormente en algunos SUB porque muchas de las configuraciones actualmente disponibles no podrían dar la breve ráfaga de agitación intensa requerida para separar las células. También será importante demostrar que son capaces de suspender eficazmente los microportadores con una agitación baja adecuada deseada para aumentar la densidad celular.

En la actualidad, el número de células producidas en microportadores en un biorreactor agitado en comparación con las obtenidas en la confluencia en un matraz en T sugiere que se ha logrado la confluencia en los microportadores. La densidad de siembra actual y la concentración de microportadores se basan en las condiciones de los matraces en T y en algunos estudios destinados a optimizarlas. Claramente, para obtener un mayor número de células, una mayor concentración de microportadores ayudaría, y se están realizando estudios en los que se agregan más nuevos durante el cultivo y luego se confía en la transferencia de perlas para poblarlos. Hasta la fecha, está resultando un problema no trivial. Además, a las densidades y escalas celulares actuales, se puede lograr una transferencia de oxígeno suficiente a través de la superficie superior del medio sin burbujeo.

A una cierta densidad y escala celular, probablemente se requerirá una mayor agitación y / o aireación burbujeante para satisfacer la demanda de oxígeno, nuevamente con todos los problemas de sensibilidad del cultivo celular (densidad celular y CDQ en este caso) a las tensiones dinámicas de fluidos, especialmente porque el burbujeo es potencialmente más dañino y el uso del surfactante protector.

Además del cambio hacia los SUB, también se ha centrado en el desarrollo de procesos de cultivo libres de suero y xenón. Una vez más, la razón principal que se cita a menudo para esto es el cumplimiento normativo y la necesidad de eliminar todos los componentes que contienen animales del proceso por razones de seguridad. Sin embargo, además de esto, también existen preocupaciones acerca de la variabilidad de un lote a otro asociada con el suero, que puede tener implicaciones significativas en el proceso, así como en la disponibilidad de suero y problemas de suministro. Como tal, ha habido una tendencia a reducir o eliminar el suero del proceso e incluso a desarrollar procesos completamente libres de suero y xenón.

La capacidad de realizar trabajos de desarrollo a pequeña escala permite que se lleve a cabo la optimización del proceso sin la necesidad de utilizar grandes volúmenes de reactivos o medios costosos. Hasta hace poco, la mayor parte del trabajo de desarrollo a pequeña escala, tanto para la producción biofarmacéutica tradicional como para la fabricación de terapias celulares, se realizaba en biorreactores más pequeños o matraces giratorios (generalmente 100 ml). Más recientemente, sin embargo, ha habido una afluencia de tecnologías de microbiorreactores que permiten estudios de alto rendimiento utilizando volúmenes de mililitros. Un ejemplo clave de esto es el biorreactor de microescala avanzado, que es un sistema de biorreactor automatizado de alto rendimiento que comprende hasta 48 recipientes de biorreactor de tanque agitado de 15 ml controlables individualmente con la capacidad de monitorear y controlar el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto. Sus características físicas se han definido recientemente, y ha demostrado ser un éxito para la investigación y el desarrollo biofarmacéuticos, y el trabajo realizado por varias empresas muestra que proporciona un rendimiento de proceso similar al de los sistemas de biorreactores de tanque de acero inoxidable a gran escala. 

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Configuración de biorreactores para densidades celulares.

En un intento por aumentar las densidades celulares, la investigación se ha centrado en trabajar hacia las condiciones óptimas de bioproceso para el cultivo de microportadores de hMSC, como el tipo y la concentración de microportadores, oxígeno disuelto, densidad de siembra celular, composición del medio (incluido el suero y libre de xeno), medio régimen de intercambio, configuración del biorreactor y estrategia de agitación, entre otros. Vale la pena señalar que, aunque estos estudios han dado como resultado un progreso significativo hacia el desarrollo de un sistema de expansión de microportadoras escalable-hMSC, todavía hay margen de mejora, particularmente dado que muchos de estos estudios solo han considerado un factor a la vez y no han considerado un enfoque multifactorial y el efecto potencial de cada parámetro sobre otros.

Del mismo modo, se han realizado numerosos estudios para investigar la capacidad de cultivar células madre pluripotentes humanas (ya sea hESC o hiPSC) en microportadores en sistemas y configuración de biorreactores de tanque agitado, y algunos estudios se centran en las células que retienen su capacidad de pluripotencia, mientras que otros buscan generar una población de células especializadas. Con las células madre pluripotentes generalmente reconocidas como un tipo de célula más difícil de cultivar incluso en sistemas de monocapa en comparación con otros candidatos a terapia celular (por ejemplo, hMSC y HSC), es alentador que las células hayan podido crecer en microportadores en condiciones de tanque agitado. Sin embargo, algunos autores señalaron que las hESC pueden inducir la diferenciación en cultivos con microportadores, lo que puede ser el resultado de las fuerzas hidrodinámicas que experimentan las células en un entorno de cultivo agitado. Sin embargo, otros estudios con células madre pluripotentes humanas no han informado de diferenciación espontánea; como tal, será necesaria una mayor investigación para identificar el verdadero efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células.

Al igual que con la industria biofarmacéutica, se han planteado preocupaciones sobre el efecto de estas fuerzas hidrodinámicas, en particular, los esfuerzos cortantes experimentados por las células durante el proceso de expansión. Existe la percepción de que las células de mamíferos en general son «sensibles al cizallamiento» debido a su falta de pared celular, se sugiere en algunos textos que esta percepción afectó adversamente el desarrollo del cultivo de células de mamíferos en suspensión libre. La preocupación por la sensibilidad al cizallamiento era excesiva, y la mayoría de los procesos industriales que utilizan células de mamíferos ahora emplean en la configuración de biorreactores de tanque agitado.

Esta cuestión de la sensibilidad al cizallamiento también es una preocupación dentro de la industria de la terapia celular y se cita a menudo como una desventaja cuando se utiliza un sistema de biorreactor de tanque agitado. Obviamente, como se mencionó anteriormente, dada la necesidad de retener los CQA de las células y no solo la viabilidad, se debe tener especial cuidado al considerar el efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células madre cultivadas en biorreactores.

El enfoque actual en la configuración de biorreactores para comprender el daño tanto a las células suspendidas libremente como a las células en microportadores se basa en una comparación del tamaño de la entidad suspendida con la microescala de turbulencia de Kolmogorov (donde la microescala de turbulencia de Kolmogorov es una estimación del tamaño de los remolinos más pequeños con precisión de orden de magnitud y es una relación entre la tasa de disipación de energía específica local y la viscosidad cinemática). Si el tamaño de la entidad es lo suficientemente pequeño en comparación con la escala de Kolmogorov, entonces no debería ocurrir daño a la célula. Para el crecimiento, la escala de Kolmogorov no debe ser menor de ∼1 / 2 a 2/3 del tamaño del microvehículo. Dado que la microescala se reduce aumentando la intensidad de la agitación, para asegurar que la microescala no sea demasiado pequeña, se ha encontrado que es mejor operar el biorreactor a la velocidad mínima requerida para suspender simplemente los dispositivos. En estas condiciones, se ha demostrado que las células mantienen su CQA durante el cultivo.

Gran parte de la investigación sobre el cultivo de células madre se ha centrado principalmente en el aspecto de expansión del proceso. Sin embargo, igualmente importante es la capacidad de recolectar las células de manera eficaz, que esencialmente requiere un enfoque de dos pasos que implica primero el desprendimiento de las células de la superficie del biorreactor y luego la separación de la suspensión celular.  Gran parte del trabajo anterior solo había recolectado muestras de mililitros para estudios de análisis y caracterización celular, y como tal, aún estaba por probarse que se podría emplear una técnica escalable para recolectar con éxito las células. En resumen, basándose en conceptos teóricos subyacentes de configuración de biorreactores desarrollados para la nucleación secundaria debido a la agitación, se puede demostrar que los aumentos en la velocidad del agitador aumentan en gran medida las tensiones que separan las células. Esto conduce a su rápido desprendimiento (en aproximadamente 7 minutos) pero una vez desprendidos, las células son significativamente más pequeñas que la escala de Kolmogorov. Por lo tanto, la recolección implicó aumentar cinco veces la velocidad de agitación en comparación con la utilizada durante el cultivo en presencia de un reactivo de disociación para eliminar las células de la superficie y, posteriormente, una etapa de filtración para separar la suspensión unicelular de la suspensión del microvehículo. Se obtuvo una eficiencia de recolección de> 95% utilizando este método y, a pesar del aumento de cinco veces en la velocidad de agitación, las células recolectadas fueron viables y conservaron los atributos de calidad clave que describen el potencial de recolectar células en cantidad y calidad suficientes. Esta técnica se ha utilizado para recolectar tres líneas celulares de donantes diferentes utilizando dos microportadores diferentes en cada caso, manteniendo las células sus CQA. Dadas las teorías subyacentes involucradas en este enfoque, el protocolo también es esencialmente escalable.

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Microportadores y biorreactores de tanque de acero agitado

biorreactores tanque de acero
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La investigación en microportadores y biorreactores de tanque de acero agitado para aplicaciones de terapia celular ha aumentado rápidamente desde mediados de la década de 2000.

Esto se debe principalmente a la constatación de que es poco probable que otras plataformas de fabricación de terapias celulares puedan generar la cantidad de células para indicaciones clínicas, que requieren > 109células por lote.

Se han realizado numerosos estudios utilizando biorreactores de tanque de acero agitado y microportadores tanto en el ámbito académico como en la industria, y aunque la escalabilidad ha sido el factor principal para cambiar a un sistema de biorreactor de tanque agitado, existen otras ventajas.

Estos incluyen la capacidad de monitorear y controlar los parámetros clave del bioproceso, la flexibilidad para operar a través de diferentes modos de operación (es decir, lote, lote alimentado, perfusión) bajo un sistema completamente cerrado y la capacidad de lograr un sistema bien mezclado, creando así un ambiente de cultivo homogéneo.

Además, hemos demostrado que también ofrecen la posibilidad de recolectar células in situ.

No se requirieren generalmente adaptaciones específicas para hacer crecer con éxito las hMSC en el biorreactor de tanque agitado.

Algunos sistemas constan de cuatro deflectores unidos perpendicularmente a la pared del recipiente con un impulsor de tres palas de paso de 45que bombeaba hacia abajo, que se agita a la velocidad mínima requerida para mantener los microportadores en suspensión.

Vale la pena señalar que esta dirección de bombeo, combinada con un diámetro del impulsor (D) de ~ 0,4 del diámetro del tanque del biorreactor (T) (aquí D / T = 0,44) permite la suspensión de microportadores con la menor intensidad de agitación.

Los biorreactores de tanque agitado utilizados junto con microportadores tienen la ventaja de que son sistemas bien entendidos y bien caracterizados, que demuestran ser rentables y fiables para la producción biofarmacéutica.

Además de esto, con la necesidad de ser lo suficientemente personalizables para acomodar múltiples células candidatas a terapias, los sistemas de microportadores son ventajosos porque los microportadores específicos están actualmente disponibles o se pueden desarrollar con carga variable, revestimiento de superficie y forma para adaptarse a tipos de células específicos.

Además, con respecto a la personalización y la flexibilidad, los biorreactores de tanque agitado permiten diferentes modos de operación, como cultivo por lotes, lote de alimentación o cultivo de perfusión, que nuevamente se pueden adaptar para cada proceso dependiendo de los requisitos específicos de la célula.

Descripción general de los estudios que utilizan un biorreactor de tanque de acero agitado y un sistema de microportador

Los estudios han investigado el cultivo de múltiples tipos de células en microportadores, incluidas las ESC de humanos y ratones, las hiPSC y las hMSC. Sin embargo, la mayor parte de la literatura sobre la expansión de microportadores de células madre se ha realizado en hMSC, con una variedad de microportadores disponibles comercialmente.

Aunque originalmente gran parte de la investigación sobre MSC y expansión de microportadores se centró en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en 2007, Frauenschuh et al. publicó el primer estudio de expansión de MSC en microportadores con el único objetivo de la producción de células.

Muchos de los estudios realizados hasta ahora han demostrado la capacidad de cultivar hMSC en microportadores, algunos incluso a escala de litros, y a lo largo de los años, ha habido un aumento constante en las densidades celulares notificadas que se pueden obtener a través de estos sistemas. Incluso con la densidad celular actual, demostramos que un biorreactor de 5 l que contiene 2,5 l de medio de cultivo puede producir tantas células como ~ 65 matraces T-175 totalmente confluentes que se cultivan en un sistema de escalamiento controlado, equivalente a ~ 2/3 de la capacidad de CompacT SelecT.

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Tecnología celular a escala en biorreactores.

Biorreactores celulares

La tecnología celular a escala en biorreactores es la ampliación de una terapia celular alogénica a granel que proporciona un modelo de negocio atractivo, con grandes lotes de productos fabricados en biorreactores utilizando un proceso similar a los adoptados por los fabricantes actuales de biofármacos que utilizan cultivo celular en suspensión libre.

Hay varios tipos de fermentadores disponibles, cada uno con diferentes ventajas y desventajas. Estos diferentes tipos se describen a continuación.

Los biorreactores de movimiento oscilante se utilizan como tecnología no invasiva y de un solo uso para el cultivo de células en suspensión.

La mezcla se logra mediante el movimiento de balanceo y, por lo tanto, no requiere partes móviles internas, lo que lo hace muy apto para la fabricación desechable.

El control se logra mediante el monitoreo no invasivo de los parámetros del proceso, como la temperatura y la concentración de oxígeno disuelto (dO2) (generalmente expresado como% con respecto a la saturación con aire (100%)), en un proceso funcionalmente cerrado, que se utiliza para aplicaciones GMP.

Los tipos de células dependientes del anclaje se pueden cultivar en microportadores en suspensión, aunque existen algunos problemas asociados con los microportadores que se quedan varados en la base durante el ciclo de balanceo, además, debido a la suave mezcla del balanceo, la recolección de células de la superficie del microportador puede tener que tenga lugar en un recipiente biorreactor.

Se han desarrollado biorreactores accionados neumáticamente para el cultivo celular en suspensión libre para proporcionar un entorno de mezcla llamado de «bajo cizallamiento», impulsado por burbujeo de aire en un impulsor vertical con base de rueda.

El movimiento de la rueda mezcla el contenido del biorreactor y ayuda a la transferencia de oxígeno y CO2permitiendo el muestreo y control del proceso.

El movimiento también es capaz de suspender microportadores, que proporcionan una superficie para que las células crezcan.

El burbujeo necesario para impulsar el mezclador es una consideración importante para el diseño y funcionamiento de biorreactores, ya que se sabe que las burbujas que estallan son perjudiciales para la viabilidad celular.

Teniendo en cuenta que el burbujeo de gas es fundamental para el funcionamiento de biorreactores de accionamiento neumático, estas implicaciones deben considerarse cuidadosamente.

Debido al impulsor vertical, el funcionamiento de estos biorreactores a volúmenes reducidos puede verse algo afectado, lo que también podría afectar la operatividad.

Un ejemplo de esto es el paso de recolección de células, que típicamente requiere una reducción de volumen in situ antes del desprendimiento de células, como se explica más adelante.

Combinado con la baja entrada de energía de la rueda que gira lentamente, este requisito podría dificultar el desprendimiento y la recolección de productos de terapia celular en biorreactores de accionamiento neumático.

Se han empleado lechos empaquetados y fluidizados para la producción de terapia celular debido a las altas densidades celulares que se pueden lograr durante la expansión.

En estos sistemas, las células adherentes se cultivan en material de empaque, mientras que el medio de cultivo se perfunde a través del biorreactor, para alcanzar densidades de células cercanas a 108células ml − 1.

La perfusión del medio de cultivo permite el seguimiento y control de las condiciones del proceso, que, como se mencionó anteriormente, es de importancia crítica en el desarrollo de un proceso de fabricación reproducible.

A pesar de las ventajas de las densidades celulares elevadas, esta estructura introduce un riesgo de ensuciamiento y la formación de gradientes de concentración axiales y radiales, especialmente a gran escala.

Además, la recolección de células de estos sistemas puede ser problemática debido a las altas densidades celulares presentes y la dificultad de introducir los fluidos de desprendimiento de manera efectiva en los lechos.

La recolección es una consideración clave que necesita tanta consideración como el cultivo celular, ya que la calidad celular debe mantenerse durante todo el proceso de expansión y recolección.

Estos sistemas se están desarrollando actualmente junto con programas clínicos, con ensayos clínicos que utilizan células placentarias expandidas para el tratamiento de la enfermedad arterial periférica, la hipertensión pulmonar y la lesión muscular.

Los biorreactores de tanque agitado son, con mucho, la plataforma más común utilizada para el cultivo de células de mamíferos, ya sea en suspensión libre o en microportadores basados en los bioprocesos actuales.

Existen convenios bien establecidos para la ampliación del funcionamiento.

Muchas empresas están aplicando este conocimiento actual al desarrollo de productos de terapia celular, utilizan habitualmente biorreactores a 50 litros.

Estos sistemas proporcionan un entorno homogeneizado para el cultivo celular, con tecnología existente disponible para el seguimiento y control de procesos.

El cultivo de células madre en tanques agitados se ha demostrado en suspensión para ESC, iPSC, MSC y HSC.

La expansión y recolección de células adherentes también se ha demostrado para la producción de MSC en biorreactores de tanque agitado, aunque las densidades celulares logradas hasta la fecha son relativamente bajas.

Sin embargo, las densidades celulares en los biorreactores agitados aumentan constantemente y probablemente experimentarán mejoras similares en el rendimiento del producto a las que se han experimentado en los bioprocesos tradicionales de cultivo celular.

Teniendo en cuenta los sólidos datos heredados que existen y las décadas de experiencia que respaldan su operación a gran escala, es probable que se produzcan varias terapias celulares alogénicas a granel en biorreactores de tanque agitado.

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Escalamiento horizontal Biorreactores

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biorreactores giratorios

El escalamiento horizontal Biorreactores es importante ya que el cultivo de células adherentes se ha realizado tradicionalmente en matraces de cultivo de tejidos, que se cultivan en incubadoras en condiciones estáticas.

Luego, la producción se puede escalar aumentando el número de matraces, con el doble de células que requieren el doble de matraces en los biorreactores.

Para una terapia autóloga, este enfoque requiere mucho espacio de sala limpia, ya que cada lote de pacientes debe estar separado y la fabricación se vuelve costosa para un gran número de pacientes.

Este método de escalado de matraces de cultivo de tejidos requiere mucha mano de obra y, debido a las condiciones estáticas, no es posible el muestreo y el control.

Algunas de estas limitaciones pueden resolverse automatizando el cultivo de matraces y ahora existen varias plataformas robóticas.

Estas plataformas son capaces de manipular hasta 100 matraces con una superficie combinada de 17 500 cm2 y se ha demostrado que reducen la variabilidad en el proceso.

El tiempo de agrupación requerido durante un proceso de fabricación a escala horizontal tiene el potencial de afectar negativamente las características del producto y, por lo tanto, limitará la escala de estas técnicas.

Ha habido un impulso para aumentar el área de superficie contenida en los frascos de cultivo de tejidos, y algunas empresas han desarrollado sistemas con múltiples capas que ofrecen hasta 25 440 cm2 de área de superficie por frasco.

Una de las preocupaciones con el uso de matraces multicapa o pilas de celdas es el desarrollo de un entorno heterogéneo dentro del sistema debido a problemas con la transferencia de masa y calor.

Por lo tanto, también se han realizado esfuerzos para producir tecnología de capas múltiples cerradas con medio perfundido de modo que los parámetros del proceso se puedan monitorear y controlar durante el cultivo.

Biorreactores y matraces giratorios.

Los matraces rotativos, comúnmente denominados botellas rotativas, se han utilizado ampliamente en el bioprocesamiento tradicional para la producción de vacunas y proteínas a partir de tipos de células adherentes.

Estos sistemas utilizan toda la superficie interna del matraz y requieren un volumen mucho menor de medio de cultivo por superficie en comparación con los matraces de cultivo estáticos.

La rotación también proporciona un nivel de mezcla, lo que mejora el intercambio gaseoso y el control de la temperatura y permite el muestreo y el monitoreo del medio de cultivo.

Al igual que con los matraces estáticos, los matraces rotativos requieren mucha mano de obra y también incurren en la penalización de tiempos de agrupación elevados, lo que puede limitar la escala potencial del proceso de fabricación.

Una limitación adicional de un proceso de botella giratoria para la fabricación de terapia celular es la limitación en el control de la composición de O2 y CO2 tanto en la fase gaseosa como en la líquida del cultivo.

Tradicionalmente, los operadores han cultivado y manipulado los recipientes giratorios en grandes almacenes con temperatura controlada y, por lo tanto, no será posible su funcionamiento a concentraciones de O2 inferiores a la atmosférica, que se utiliza comúnmente para el cultivo de terapia celular.

Dispositivos de fibra hueca

Los biorreactores de fibra hueca se pueden utilizar para proporcionar áreas de gran superficie para la expansión celular.

sistema funcionalmente cerrado proporciona 21 000 cm2 por biorreactor, cumple con las normas GMP y un solo operador puede operar y recolectar varias unidades.

El medio se perfunde a través de las fibras, lo que significa que se puede realizar un seguimiento y control automatizados de las concentraciones de metabolitos, lo cual es importante para mantener la consistencia del proceso.

Debido a la naturaleza del sistema de fibras huecas, existe la posibilidad de que se formen gradientes de concentración longitudinales a medida que el medio de cultivo o el reactivo de disociación fluyen por las fibras.

Además, la expansión a gran escala utilizando múltiples unidades de fibra hueca requiere pasos de crioconservación entre procesos, ya que el número de unidades requeridas aumenta exponencialmente y rápidamente se convertiría en un costo prohibitivo.

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Productos alogénicos

Productos-alogenicos

Las terapias regenerativas en las que el donante y el receptor son personas diferentes se conocen como productos alogénicos. Esto crea un modelo de negocio listo para usar, que es mucho más parecido a los biofarmacéuticos actuales, lo que representa una atractiva oportunidad comercial, ya que los productos celulares pueden almacenarse a largo plazo y siempre están disponibles para su entrega. Este modelo de negocio ha sido adoptado por varias empresas de medicina regenerativa y han invertido bastante en biorectores especializados.

A diferencia de las terapias autólogas, los productos alogénicos tienen el potencial de ampliarse, beneficiándose de las economías de escala experimentadas por los procesos en bioreactores tradicionales. Hay una gran cantidad de tecnología de expansión disponible para la ampliación de productos celulares, con importantes datos heredados que respaldan su diseño y operación a gran escala. La fabricación de una gran cantidad de dosis de producto de esta manera permite a las empresas enfocarse en indicaciones clínicas con un gran número de pacientes, creando la perspectiva de una mayor recompensa financiera. El tamaño de lote más grande para procesos alogénicos también reduce la carga de la garantía de calidad, que debe aplicarse a cada lote de paciente para una terapia autóloga. Además, una terapia alogénica reduce el impacto de la variabilidad del donante en el proceso, ya que los bancos de células se amplían para tratar a varios pacientes. El valor de la consistencia del proceso no debe subestimarse, ya que el aumento de los costos de desarrollo y validación de un proceso en biorreactores variable podría ser sustancial. Las terapias alogénicas también introducen la posibilidad de utilizar tipos de células madre pluripotentes, como las células madre embrionarias, que ofrecen un enorme potencial en el tratamiento de una amplia gama de indicaciones clínicas.

Sin embargo, el uso de células madre pluripotentes presenta desafíos de seguridad dentro de la purificación posterior y la eliminación de células que tienen el potencial de formar teratomas en el paciente. La introducción de altos niveles de caracterización de procesos y productos probablemente aumentará los costos directos del proceso, desde la formación de un banco de células maestro hasta la prueba del producto final. También existen problemas potenciales si la terapia celular es ajena al sistema inmunológico del receptor, aunque algunos tipos de células han mostrado un privilegio inmunológico relativo después del parto. Este problema tiene el potencial de limitar los tipos de células susceptibles de procesos alogénicos a gran escala, aunque se ha sugerido que se pueden derivar múltiples líneas celulares para proporcionar una compatibilidad razonable para la mayoría de los pacientes. El desarrollo de un producto alogénico también requiere un banco de células maestras, a partir del cual se puede fabricar el producto. El costo de desarrollar un banco de células maestras suele ser alto y no se puede recuperar hasta que el producto reciba la aprobación del mercado, lo que aumenta la brecha de financiamiento en el desarrollo. La calidad y consistencia del banco maestro es fundamental, porque una vez creado no se puede modificar. Esto requiere un alto nivel de comprensión del producto junto con rigurosas pruebas de seguridad y calidad para garantizar que el producto del banco de células maestras sea adecuado para la fabricación del producto de terapia celular. Cualquier cambio en el proceso de fabricación durante el desarrollo clínico requerirá la validación del proceso para garantizar que siga siendo comparable antes y después del cambio. Este aspecto requerirá mucho tiempo y recursos, así como el desarrollo de ensayos funcionales para demostrar que no ha habido cambios en la seguridad o función del producto de terapia celular.

Plataformas de fabricación en bioreactores de terapia celular

Con múltiples terapias basadas en células en fase avanzada de desarrollo clínico y avanzando hacia la producción comercial, está claro que la selección de la tecnología de fabricación adecuada es cada vez más importante. Dada la diversidad de tipos de células, indicaciones de enfermedades y modelos comerciales, es probable que se utilicen múltiples plataformas de fabricación en la producción de terapias celulares. Se debe prestar especial atención a la selección de plataformas de fabricación antes del desarrollo clínico, para producir productos de terapia celular escalables y rentables.

Con respecto a la producción de terapia celular, hemos utilizado los términos escalado (escalado horizontalmente) y escalado (escalado verticalmente) de acuerdo con el Glosario de Terapia Celular y Medicina Regenerativa PAS84, donde el escalado se define como el aumento de la producción por un aumento en el número de unidades, y la ampliación se define como aumentar el tamaño del proceso en lugar de aumentar la producción mediante un aumento en el número de unidades.

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Paradigmas de biorreactores en la fabricación de terapia celular

Las terapias celulares representan un desafío distintivo de los procesos en biorreactores, debido a los diferentes paradigmas que existen en el campo para tratar enfermedades agudas y crónicas mediante la aplicación de células (p. Ej., MSC) o tejidos (p. Ej., Piel). El desarrollo de productos de terapia celular dependerá en gran medida de si las células son universales (alogénicas), compatibles con donantes (haplobank) o específicas del paciente (autólogas), cada una con su propio conjunto de desafíos de fabricación y factores comerciales.

Haplobank

Para limitar las complicaciones asociadas con el rechazo inmunológico de las terapias celulares, se ha sugerido que se pueden construir bancos de células, que contienen un número suficiente de muestras de antígeno leucocitario humano (HLA) para cubrir una gran población de pacientes. Este concepto ha sido impulsado por el uso de tipos de células pluripotentes como terapia celular, ya que la progenie de células diferenciadas seguirá conteniendo HLA con el potencial de causar el rechazo del trasplante. Se ha demostrado que 200 líneas celulares embrionarias de ovocitos donados al azar pueden proporcionar una correspondencia beneficiosa para alrededor del 80% de la población japonesa. El emparejamiento de donantes suficiente de esta manera permitiría la producción de un producto de terapia celular para múltiples pacientes, aunque un haplobank no sería suficiente para dirigirse a toda una población de pacientes.

Productos autólogos

Las terapias celulares en las que el donante y el receptor son el mismo individuo se conocen como productos autólogos. Estos productos son específicos para el paciente y su fabricación debe ampliarse para garantizar que el material del paciente esté segregado y se evite la contaminación cruzada del material. La reducción de las terapias autólogas probablemente requerirá múltiples instalaciones de fabricación, creando la necesidad de automatización local y la demostración de comparabilidad entre estos sitios. La atención médica personalizada crea un modelo de negocio basado en servicios donde la compleja logística que rodea la fabricación y entrega de células vivas crea una oportunidad significativa. Sin embargo, esta logística debe considerarse cuidadosamente, ya que existen costos operativos significativos asociados con la implementación de esta red de suministro para un producto con una vida útil corta.

La principal ventaja de las terapias con células autólogas es la falta de rechazo inmune asociado con el material de trasplante de donante, lo que elimina la necesidad de medicamentos inmunosupresores que agregarían un costo significativo al tratamiento. Además de las complicaciones inmunes, el uso de material autólogo también reduce en gran medida el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas entre los pacientes, que generalmente forma parte de las pruebas de seguridad durante el proceso de fabricación. Las terapias autólogas brindan el potencial para dispositivos de punto de atención, donde los dispositivos funcionales cerrados pueden usarse para fabricar terapias celulares al lado de la cama. Estos típicamente implican el aislamiento y enriquecimiento de las células directamente del paciente y se devuelven en el sitio como «mínimamente manipulados», lo que tiene la ventaja de no estar regulados como un medicamento. Las terapias autólogas también tienen una ventaja económica, ya que generalmente incurren en costos de capital reducidos para la puesta en marcha, y las operaciones unitarias pueden ampliarse para adaptarse a la demanda del mercado. Este enfoque de reducción de escala también reduce el número de duplicaciones de la población de productos, lo que puede conducir a la inestabilidad cromosómica y a la reducción de la calidad del producto, si el producto sufre múltiples duplicaciones de población.

A pesar de estas ventajas, quedan muchos desafíos en el desarrollo de terapias celulares autólogas. La extracción de células de cada paciente requiere una biopsia, lo que conlleva un riesgo inherente para el paciente y requiere tiempo adicional en la clínica. También es posible que la ruta de la enfermedad objetivo sea con las propias células del paciente y, por lo tanto, sería mejor evitar usarlas. La variabilidad inherente entre los donantes también es alta, que debe controlarse durante la fabricación, pero puede mejorarse estratificando las poblaciones de pacientes en grupos según características como la edad o el género.

Los problemas relacionados con la carga de la prueba de calidad y la logística se suman a la complejidad para la producción y entrega de una terapia celular autóloga rentable. Este aspecto se debe en gran medida a la reducción de las economías de escala con la ampliación de un proceso y la menor demanda del mercado debido a la menor cantidad de pacientes. La entrega de productos basados en células autólogas puede ser compleja debido a los métodos de conservación a corto plazo utilizados para el transporte, lo que introduce costos logísticos significativos asociados con su suministro. Un problema clave con este enfoque es el riesgo de que un lote de fabricación no cumpla con las especificaciones y el paciente no reciba su tratamiento. Este problema podría tener enormes implicaciones para la salud del paciente y debe considerarse cuidadosamente.

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Tipos y productos de células madre en biorreactores

Las células madre se definen como células que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en células maduras de un tejido particular. Es esta capacidad de autoperpetuarse y producir grandes cantidades de células terapéuticamente activas lo que ha generado un interés significativo en torno al uso de células madre para no solo tratar los síntomas, sino potencialmente curar las afecciones subyacentes.

Las terapias con células madre han existido durante varios años con el primer trasplante alogénico exitoso de médula ósea que tuvo lugar en 1968. La médula ósea contiene varias poblaciones de células madre, particularmente relacionadas con la producción de células sanguíneas. Las células madre hematopoyéticas (HSC) forman la gran mayoría de los ensayos clínicos de terapia celular y se están utilizando para tratar tumores malignos hematológicos, así como otras indicaciones oncológicas. Estas HSC generalmente se trasplantan de un paciente a otro sin que se produzca ninguna expansión celular; sin embargo, hay sistemas disponibles para expandir estas células en suspensión. Además de las HSC, la médula ósea también contiene una población de células adherentes y auto-renovables, denominadas células madre mesenquimales o estromales.

Desde que Arnold Caplan introdujo por primera vez el término células madre mesenquimales a principios de la década de 1990, se ha generado mucha emoción en torno al potencial de las MSC para tratar y, en algunos casos, curar enfermedades, como diabetes, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. Este interés se debe principalmente a su facilidad de aislamiento, así como a su capacidad de proliferar ex vivo en condiciones de cultivo apropiadas. Según se informa, las MSC humanas se han aislado de muchos tipos de tejidos como la médula ósea, el tejido adiposo, el cordón umbilical y la sangre del cordón umbilical con su supuesto mecanismo de acción pensado para ser una combinación de: modulación del sistema inmunitario del propio paciente, liberación de factores tróficos para estimular la regeneración del tejido nativo y reducción de la respuesta inflamatoria del tejido nativo del paciente. Parte del criterio de definición para un MSC es la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidos osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Junto con las características deseables descritas, las MSC también han recibido mucha atención debido a su capacidad para el trasplante no compatible de donantes sin formación ectópica y su no injerto después de la infusión, logrando su modo de acción a través de un mecanismo de «golpear y correr». Son estas propiedades únicas las que han convertido a las MSC en una opción popular para las compañías que desarrollan productos de células madre mediante biorreactores, con varias empresas en el desarrollo clínico en etapas avanzadas de productos dirigidos a trastornos inmunes, enfermedades cardiovasculares y condiciones neurológicas. 

Desde el descubrimiento de las células madre embrionarias en 1998, las células madre pluripotentes han sido investigadas como una fuente prometedora de células madre debido a su capacidad de autorrenovarse y formar todos los tejidos del cuerpo. En 2010, 3mpresas comenzaron a adentrarse en el desarrollo clínico con productos alogénicos para el tratamiento de la lesión de la médula espinal.  Las células humanas maduras, como los fibroblastos dérmicos, también pueden reprogramarse para convertirse en pluripotentes utilizando una técnica que implica la transducción de factores de transcripción definidos. Esta novedosa técnica permite el desarrollo de células madre pluripotentes específicas del paciente, denominadas células madre pluripotentes inducidas. Parece que a medida que el campo se desarrolla, las células iPS toman cada vez más el lugar de los ESC como la célula pluripotente de elección con restricciones éticas reducidas asociadas con la destrucción y manipulación de embriones humanos. Las células iPS humanas también tienen el potencial de ser específicas del paciente, lo que reduce el potencial de rechazo inmunológico y abre oportunidades para su uso como terapia celular personalizada.

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Número de celdas requeridas en Biorreactores en tratamientos celulares

Dado que hay relativamente pocos tratamientos de terapia celular en el mercado, en particular los tratamientos con células madre, es difícil determinar la cantidad exacta de células requeridas por dosis o la cantidad de dosis por lote en los biorreactores. Sin embargo, prevé que los tamaños de lote oscilarían entre 109y 1012células, aunque para cada tratamiento, la cantidad de células requerida variará dependiendo de la indicación clínica a la que se dirija. Se pueden determinar cantidades aproximadas de células a partir de estudios preclínicos y clínicos, así como a partir de terapias aprobadas.

La EICH aguda tiene una incidencia relativamente baja, pero suponiendo que 10 000 pacientes por año requieran el tratamiento, esto requeriría, por lo tanto, una producción anual de 4 × 1012 hMSC.  Además, como parte de un estudio clínico, también se informó que para el tratamiento del infarto agudo de miocardio, se administró una dosis que oscilaba entre 0,5 × 106 y 5 × 106 hMSC kg − 1 por paciente [16].

Lo que es evidente es que, si se tratara una indicación clínica con una población de pacientes significativa, el número de células por lote probablemente oscilaría entre 109y 1012células, y dado que el cultivo de células madre todavía se logra predominantemente a través de un tamaño pequeño, sistemas de expansión planos y estáticos, que no producirán este número de células, se deben considerar otras plataformas para el cultivo a gran escala de células madre.

A diferencia de los sistemas de expresión comunes utilizados en el bioprocesamiento tradicional, como Escherichia coli y células de ovario de hámster chino (CHO) adaptadas a la suspensión, la mayoría de los candidatos celulares que se investigan actualmente para su uso como terapias celulares dependen del anclaje, lo que significa que requieren una superficie para adherirse y proliferar. Aunque este no es un fenómeno asociado solo con células destinadas a la terapia celular, por ejemplo, las células Vero se usan comúnmente para la producción de vacunas y también dependen del anclaje, tiene mayores implicaciones para las células destinadas a la terapia celular porque reiteran lo que se mencionó anteriormente acerca de la calidad celular, es de suma importancia que las células no se vean comprometidas en los biorreactores de ninguna manera, ya que el producto de interés es la célula viva. Esto no quiere decir que la calidad de las células utilizadas como expresión no sea importante en la producción de vacunas o proteínas terapéuticas, pero en última instancia, el producto de interés es lo que expresa la célula y no la célula misma. Para examinar esto más a fondo, si una célula utilizada como un sistema de expresión se comprometiera con respecto al cariotipo, como la línea celular CHO establecida se ha convertido, por ejemplo, esto no necesariamente afecta la calidad de la proteína de interés, aún para la célula terapias, es poco probable que esto sea aceptable para el regulador. También vale la pena señalar que los tipos celulares comúnmente utilizados para la producción biofarmacéutica son líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, para las terapias celulares, las células tienen un período finito de expansión y senescencia durante un cultivo in vitro prolongado dentro del biorreactor. Se identificó que dentro de los 43–77 días del cultivo in vitro, las hMSC demostraron anormalidades morfológicas, agrandamiento, expresión atenuada de marcadores de la superficie celular y senescencia celular. Además, se ha informado que han surgido anormalidades cariotípicas con el cultivo prolongado in vitro de hESC, por el cual las células han adquirido el cromosoma 17q y el cromosoma 12. Por lo tanto, debe prestarse especial atención a las condiciones de fabricación, particularmente cuando las células sufren duplicaciones de múltiples poblaciones para lograr el número de células deseado.

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