Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores

En el siguiente texto, se hace referencia a una serie de métodos comunes de diseño DoE, como los métodos de Plackett-Burman, Taguchi, Box-Behnken y Box-Wilson. Estos cuatro diseños se explican brevemente a continuación; sin embargo, en la práctica habitual también se aplican otros enfoques de diseño similares o equivalentes.

Método de Plackett-Burman

Descripción

Este método se refiere al trabajo original de 1946 de Plackett y Burman, donde presentaron diseños experimentales para investigar la dependencia de la cantidad medida en un número de variables o factores independientes. En este trabajo, describen los diseños factoriales de dos niveles donde el número de experimentos es un múltiplo de 4. Discuten en particular los principios básicos de DoE donde se prueban L niveles en un número limitado de experimentos para minimizar la varianza de las estimaciones de estas dependencias. Sin embargo, las interacciones entre los factores se consideraron insignificantes.

Solución

La solución a este problema es encontrar un diseño experimental donde cada combinación de niveles para cualquier par de factores aparezca el mismo número de veces, a lo largo de todas las corridas experimentales. Un diseño factorial completo cumpliría con este criterio, pero la idea es encontrar diseños más pequeños.

Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores

Aqui se presenta una comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores. Es importante seleccionar el método DoE adecuado en función de los objetivos específicos del estudio y de las limitaciones experimentales.

Método de Taguchi

Descripción

El método es similar al método de Plackett-Burman en su versión básica y propone varios enfoques para diseños experimentales que utilizan FFD de dos, tres y niveles mixtos. El método Taguchi se describe ocasionalmente en la literatura como un método de control de calidad porque ese era el propósito original del método. En algunos casos, el método se puede utilizar en línea mientras se ejecuta el proceso. Taguchi ha publicado varias guías para aplicar los métodos de diseño.

Aplicaciones

Este método se utiliza en una amplia gama de industrias, incluyendo la fabricación, la electrónica y la industria alimentaria.

Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores

El método Taguchi ofrece una serie de ventajas sobre otros métodos DoE, incluyendo su simplicidad, eficiencia y robustez. Sin embargo, también tiene algunas limitaciones, como su incapacidad para modelar interacciones complejas entre factores.

Método de Box-Wilson

Descripción

Éste es en principio equivalente a un CCD común como se describió anteriormente. El método de Box-Wilson investiga el impacto de las variables experimentales en la salida de respuesta que utilizan CCD para utilizar un diseño de superficie de respuesta, que se elige comúnmente para la optimización de la respuesta. Box y Wilson sugirieron el uso de un modelo polinomial de segundo grado.

Aplicaciones

Este método se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la química, la ingeniería y la ciencia de los materiales.

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El método Box-Wilson es una poderosa herramienta para la optimización de procesos complejos. Sin embargo, puede ser computacionalmente intensivo y requerir un gran número de experimentos.

Método de Box-Behnken

Descripción

Se refiere a los diseños experimentales para RSM descritos por Box y Behnken. En el método, cada factor se coloca en uno de tres valores igualmente espaciados, generalmente codificados como -1, 0, +1. El diseño también debe ser suficiente para ajustar un modelo cuadrático. La relación entre el número de puntos experimentales y el número de coeficientes en el modelo cuadrático debe ser razonable. La varianza de estimación debería depender más o menos solo de la distancia del centro y no debería variar demasiado dentro del cubo más pequeño que contiene los puntos experimentales. Los diseños de Box-Behnken se consideran eficientes en cuanto a la cantidad de experimentos necesarios.

Aplicaciones

Este método se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la química, la ingeniería y la ciencia de los materiales.

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Los diseños Box-Behnken son una opción eficiente para la optimización de procesos con un número moderado de factores. Sin embargo, no son tan eficientes como los diseños factoriales completos

Método DoEDescripciónUtilidad
Diseño de Plackett-BurmanDiseños fraccionarios de dos niveles para estudiar k=N-1 variables en N corridas, donde N es un múltiplo de 4. Los diseños de mayor número de N son diseños no geométricos. Los niveles se presentan a menudo como (+) y (-), y los valores se varían sistemáticamente en un plan experimental. Los diseños P-B se llevan a cabo típicamente como diseños de Resolución III o IV (2k-P, 21k-P).Los diseños P-B de resolución III y IV se aplican comúnmente cuando se criban un gran número de componentes de medios (ver detalles en las Tablas 15.2-15.5). En particular, cuando el medio contiene >20 componentes, la reducción de la resolución ahorra mucho trabajo.
Diseño de TaguchiUna alternativa similar al diseño PB basada en tablas con nivel (1) y nivel (2). Los diseños simples de Taguchi son muy similares a los diseños PB, pero también podrían extenderse a más niveles.Los diseños de Taguchi, siendo comúnmente aplicados en el control de calidad industrial, son preferidos en el diseño de medios. Debido a su adaptación a muchos parámetros de calidad, también es muy útil en el diseño de medios de cultivo con muchos componentes.
Diseño de Box-BehnkenDiseños de tres niveles para su uso con superficies de respuesta. Los diseños BB se forman combinando factoriales de 2k con diseños de bloques.Los diseños BB permiten reducir el número de experimentos. Como el diseño de medios podría beneficiarse de las pruebas a más de dos niveles de concentración, esto es muy útil.
Diseño de Box-WilsonUn diseño equivalente con un CCD común como se describió anteriormente con puntos centrales que se aumentan con un grupo de «puntos estrella» que permite la estimación de la curvatura.
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Evaluación del Diseño Experimental en biorreactores.

En la una evaluación del diseño experimental en biorreactores  vez que los experimentos han sido llevados a cabo de acuerdo al plan de diseño experimental y los resultados de las variables de respuesta han sido compilados, se utiliza la regresión lineal múltiple (MLR, por sus siglas en inglés).

El propósito de la MLR es evaluar si el espacio experimental ha sido diseñado de manera ortogonal y si permanece igual después de que los experimentos han sido realizados.

En la MLR, el modelo matemático describe una relación entre una o más variables independientes y una variable de respuesta como Yi = 𝛽0 + 𝛽1Xi1 + 𝛽2Xi2 + · · · + 𝛽p Xip + 𝜀i donde i = 1,2, … ,n.

Las interacciones más complejas debido a la covariación se describen mediante términos lineales o cuadráticos.

Sin embargo, los términos de interacción u otros términos complejos deben evaluarse para ver si ofrecen contribuciones aceptables al modelo en comparación con la incertidumbre de la contribución (relación señal-ruido).

En la evaluación del diseño experimental en biorreactores  de la contribución de cada coeficiente y la posterior optimización del modelo, el objetivo es reducir el factor de desviación del modelo 𝜀i.

Al caracterizar una superficie de respuesta, los términos de covariación describen su asimetría, mientras que los términos cuadráticos describen su curvatura.

En un diseño completo, debido al número de grados de libertad, es probable que los términos que describen la interacción y la curvatura puedan incluirse en el modelo MLR.

Al evaluar un FFD mediante MLR, es práctica común respaldar los términos lineales con un número limitado de términos complejos.

En un FFD, dichos términos a menudo están confundidos entre sí.

Si el diseño no es ortogonal, la regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS) es una mejor alternativa.

Este método evaluación del diseño experimental en biorreactores  también puede ser utilizado cuando hay varias respuestas correlacionadas en el conjunto de datos.

PLS puede proporcionar entonces un método de evaluación más robusto que es útil incluso si hay un número limitado de datos faltantes en la matriz de respuesta.

Las evaluaciones del modelo en las aplicaciones de diseño en los medios discutidas o citadas a continuación son en su mayoría ejemplos de estos procedimientos analíticos.

Para un caso con cinco factores, necesitamos ya sea 16 (25−1) o 8 (25−2) factores en los experimentos.

El último diseño se utiliza principalmente en pruebas de robustez, donde se prueba la sensibilidad de la variación de la variable de respuesta en un conjunto reducido de experimentos alrededor de un óptimo de la variable de respuesta.

La variación de las variables generalmente se realiza en pasos muy pequeños alrededor de un campo específico de interés, como una composición preferida de un medio de cultivo, para evaluar la estabilidad del proceso.

Comúnmente, el modelo se valida mediante dos residuos diagnósticos.

El primero de estos, el valor R2, es la fracción de la variación de las respuestas que puede ser explicada por el modelo.

Esto describe la bondad de ajuste, o qué tan bien pueden ser reproducidas las ejecuciones actuales en un modelo matemático.

El otro residuo, el valor Q2, es la fracción de la variación de la respuesta predicha por el modelo según la validación cruzada.

Esto describe la bondad de predicción, o qué tan bien pueden predecirse nuevos experimentos utilizando el modelo matemático.

Las pruebas de R2 y Q2 a veces son descuidadas, lo que desafortunadamente reduce la posibilidad de apreciar completamente los resultados.

Los valores típicos que indican una buena calidad de robustez son R2 > 0.75 y Q2 > 0.75. Los valores inferiores a 0.25 normalmente se considerarían inútiles.

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Diseño de experimentos de cribado en biorreactores

En el diseño de experimentos en biorreacotres la aproximación más eficiente para comenzar un nuevo medio de biorreactor es mediante experimentos de cribado de los componentes de dicho medio considerados importantes para la capacidad del mismo.

Estos diseño de experimentos en biorreacotres de cribado deben realizarse desde esquinas seleccionadas en el espacio experimental. El procedimiento se conoce comúnmente como un diseño factorial fraccionado (FFD) porque solo se investiga una fracción de los posibles valores de las esquinas en el espacio de diseño.

Las tres variables de factor seleccionadas se someten a prueba en dos niveles de valores, y cada variable se prueba dos veces a niveles bajos y altos. En la optimización del diseño del medio, las tres variables podrían ser tres componentes clave de nutrientes a dos niveles de concentración cada uno.

Este primer paso del plan de Diseño de Experimentos en biorreactores (DoE) requiere una cuidadosa consideración basada en la experiencia previa. Puede ser que los protocolos de cultivo ya hayan establecido variables de factor bien definidas, como la concentración de componentes en el medio y la configuración de variables de estado en el fermentador. Sin embargo, la selección de variables y sus niveles depende completamente del juicio del experimentador y del conocimiento previo sobre el proceso estudiado. Elecciones inapropiadas limitarán la utilidad de los resultados, haciendo necesario llevar a cabo nuevos diseño de Experimentos en biorreactores con otras variables y niveles.

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El número de diseño de experimentos en biorreacotresen un diseño factorial fraccionado (FFD) de dos niveles se puede describir matemáticamente como 2^n-k, donde n es el número de factores que se investigarán a niveles bajos y altos, y k es el número de pasos para reducir el diseño experimental. Si, por ejemplo, participan cinco variables en el experimento, terminará con 16 (2^5-1) o 8 (2^5-2) experimentos, respectivamente, dependiendo de cuántos pasos se reduzca el diseño.

Sin embargo, en la práctica actual, este procedimiento rara vez se realiza de manera sistemática; en cambio, se elige un nivel de reducción apropiado. El cribado se mejora mediante réplicas en el punto central del dominio experimental, con el propósito de recopilar valores adicionales de respuesta y, al mismo tiempo, determinar el error experimental para la respuesta. La reducción de diseño de experimentos en biorreacotres de factores disminuye la calidad estadística del cribado. Esto será evidente en los parámetros de rendimiento estadístico de bondad de predicción y bondad de ajuste. El conjunto completo de experimentos debe realizarse en un orden aleatorio para evitar errores sistemáticos. Una causa típica de errores sistemáticos es cuando se realizan tres experimentos en el punto central de un diseño uno tras otro utilizando el mismo procedimiento experimental.

Por lo tanto, la aleatorización debe aplicarse para ocultar al experimentador los resultados esperados, ya sean buenos o malos. El resultado típico de un experimento de cribado para medios de cultivo es la identificación de algunos componentes importantes en el medio. Estos componentes deben ser investigados más a fondo en un nuevo diseño experimental con el propósito de determinar los valores óptimos de los factores. Esto requiere un plan experimental más elaborado, como un diseño central compuesto en caras (CCF) o un diseño central compuesto circunscrito (CCC).

En el caso del CCF, se incluyen valores adicionales (por ejemplo, concentraciones) de las variables en los puntos centrales de la superficie entre las esquinas del espacio experimental. En el CCC, estos se desplazan fuera del espacio a la misma distancia desde el punto central que la distancia desde el punto central hasta las esquinas. Teóricamente, el diseño CCC es algo mejor que el diseño CCF porque cubre un volumen más grande en el espacio de diseño.

Los resultados de los diseño de Experimentos en biorreactores CCF o CCC se representan en un gráfico de contorno o en una superficie de respuesta donde se visualiza claramente el óptimo. Este último paso también ha dado nombre al procedimiento comúnmente conocido como la metodología de superficie de respuesta (RSM, por sus siglas en inglés).

Debería enfatizarse que tanto variables cuantitativas como cualitativas pueden incluirse entre los factores, al igual que factores multiniveles cuantitativos y cualitativos. Por ejemplo, en un caso con dos factores cualitativos, X1 (con cuatro niveles discretos) y X3 (con tres niveles discretos), y un factor cuantitativo, X2, se puede generar un diseño como se muestra en la Figura 15.6. Sin embargo, en este caso, no es posible utilizar puntos centrales entre los niveles discretos de los factores X1 y X3. En su lugar, un punto central puede posicionarse en uno de los niveles discretos de las variables cualitativas o en un nivel intermedio de la variable cuantitativa. Un ejemplo típico en el diseño de medios es cuando se comparan dos alternativas diferentes de componentes de medios.

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Diseño de experimentos de biorreactores para el desarrollo y optimización de medios .

El diseño de experimentos de biorreactores (DoE) se ha convertido en una metodología ampliamente aceptada para investigar las relaciones estadísticas entre las variables de entrada y salida de sistemas técnicos.

Los sistemas de procesos y producción, donde tienen lugar transformaciones físicas, químicas o biológicas, pueden beneficiarse sustancialmente mediante el uso de DoE como una herramienta de diseño y optimización.

En particular, los bioprocesos con la exigente tarea de diseñar medios de cultivo complejos para biorreactores han podido aprovechar en gran medida esto.

En la planificación de experimentos de biorreactores para evaluar y optimizar la composición de un medio de producción, la metodología DoE es particularmente útil para evitar sesgos experimentales y reducir significativamente el número necesario de experimentos de biorreactores.

Los procedimientos para aplicar la metodología DoE al diseño de medios son directos.

Se investigan factores de entrada definidos, como mezclas y concentraciones de componentes del medio, añadidos a un cultivo en transformación, a partir del cual se obtienen factores de salida o respuestas, como la concentración y tasas de formación de la(s) molécula(s) o células objetivo u otras entidades de importancia.

Sin embargo, la fortaleza de DoE radica en que también revela cómo las interacciones entre los factores de entrada (es decir, los componentes del medio o posiblemente también otros parámetros del proceso) influyen en las respuestas de salida.

Estas interacciones a menudo son difíciles de descubrir e interpretar con otros métodos experimentales.

Sin embargo, la conversión en un biorreactor y en su medio de cultivo es más compleja que un equilibrio entre factores de entrada y salida.

La mayoría de los insumos ejercen sus efectos como una carga inicial de efectos múltiples sobre el bioproceso en transformación.

Sin embargo, cualquier persona con experiencia en bioprocesamiento es consciente de que las acciones y efectos se desplazan en el tiempo durante un procedimiento de cultivo.

Algunos factores se establecen desde el principio del proceso, mientras que otros aparecen más tarde, por ejemplo, al alimentar componentes del medio en ciertos momentos o períodos.

El inicio de cambios en el metabolismo causados por la activación o desactivación de componentes, como factores de crecimiento, vitaminas y agentes estresantes microbianos, complica aún más el curso de los eventos en el proceso.

En bioprocesos recombinantes, la inducción de la expresión de una proteína recombinante es otro parámetro dependiente del tiempo de importancia.

Además, los factores del medio se combinan con parámetros operativos del proceso como la temperatura, la agitación y la aireación.

Por lo tanto, las interacciones entre los parámetros del medio son muy relevantes para investigar; la metodología DoE nos permite hacerlo.

Fundamentos de la Metodología de Diseño de Experimentos de biorreactores.

La fortaleza de la metodología DoE, en comparación con los métodos de optimización que varían una variable a la vez, radica en que se puede lograr un resultado confiable con solo unos pocos experimentos de biorreactores.

En DoE, se puede evaluar la dirección más favorable para moverse en el espacio de diseño factorial y encontrar un óptimo real.

Es posible quedar atrapado en un cuasi-óptimo al variar solo una variable a la vez, incluso en el caso de dos variables al mantener constante la variable X1; se realizan cinco experimentos de biorreactores variando la variable X2.

A partir del óptimo obtenido, luego se varía la variable X1 en otros cuatro experimentos. Nunca se alcanza un óptimo correcto porque hay una dependencia entre las dos variables.

En cambio, al variar simultáneamente tanto X1 como X2 y analizar el resultado con procedimientos DoE, se puede revelar la dirección del óptimo real.

Al optimizar medios de cultivo o realizar otros estudios de optimización de bioprocesos, este enfoque es claramente preferible, ya que con un enfoque de una sola variable es probable que el experimentador termine en concentraciones de medios cuasi-óptimas.

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Cromatografía líquida de alta resolución en línea

Cromatografía líquida de alta resolución en línea para la estimación de subproductos de la fermentación mixta de ácidos.

El sensor virtual en la cromatografía líquida utiliza una sonda NIR in situ con una ventana de longitud de onda fija para adquirir una señal de absorbancia que está relacionada con la concentración total de biomasa. Esta señal se combina con datos de un HPLC en línea, donde los picos del cromatograma se analizan para metabolitos seleccionados en el medio, siendo importantes para supervisar el estado metabólico de la cultura de E. coli que expresa la proteína.


Después de la evaluación de las áreas de los picos, los datos de HPLC se convierten en concentraciones de acetato, glucosa, lactato y formiato. Al transformar las señales de HPLC y biomasa a concentraciones específicas (g de metabolito/g de célula por hora), se monitorea el estado fisiológico y se utiliza para determinar la tasa de alimentación en el cultivo por lotes alimentado.

La ventaja en este caso es que la instrumentación en el sensor virtual está bien establecida, y los métodos robustos y el HPLC analizan varios analitos por corrida. La desventaja es el tiempo de espera relativamente largo del HPLC (hasta 25 minutos) en comparación con la sonda NIR, que responde en segundos.

En particular, este enfoque de sensor virtual brinda la oportunidad de controlar el desbordamiento metabólico de la fermentación de ácidos mixtos y el metabolismo de desbordamiento de glucosa en un cultivo por lotes alimentado para la producción de proteína verde de fluorescencia recombinante (GFP) en E. coli.

La parte computacional del sensor virtual utilizó ecuaciones cinéticas básicas y sumas para la estimación de tasas específicas y concentraciones totales de metabolitos. Se evaluaron dos estrategias de control para la alimentación del medio en el cultivo por lotes alimentado: (i) controlar las tasas específicas de metabolismo de desbordamiento y metabolitos de fermentación de ácidos mixtos en valores preestablecidos fijos, y (ii) controlar la concentración de la suma de estos metabolitos a un nivel establecido.


Los resultados indican que la última estrategia fue más eficiente para mantener un alto título y una baja variabilidad de la proteína verde de fluorescencia recombinante producida. El estudio presentado muestra cómo la variabilidad de un producto de proteína recombinante puede reducirse mediante el control basado en un sensor virtual. El sensor virtual reduce la necesidad de instrumentación y análisis fuera de línea. El principal objetivo de la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT, por sus siglas en inglés), de aumentar la estabilidad del proceso y reducir la variabilidad de los parámetros clave del proceso, en particular el título del producto, se puede lograr con el enfoque del sensor virtual.


Además en la cromatografía líquida, se puede observar que el controlador no debe ser muy preciso (es decir, mostrar una rápida declinación, pequeños fallos estacionarios) para lograr una baja variabilidad en realidad.

Además, el resultado del estudio indica que el enfoque de control fisiológico no es necesariamente la estrategia de control más exitosa.

Sin embargo, sería deseable en la cromatografía líquida una mayor simplificación de la configuración del sensor virtual. Si un menor número de sensores de hardware puede lograr la estrategia de control, se mejoraría la aplicabilidad industrial y se reducirían aún más el mantenimiento y el suministro.


Nariz electrónica y espectroscopía NIR para el control de la producción de toxina del cólera

El NIR y la EN se utilizaron para monitorear y controlar un cultivo por lotes alimentado de Vibrio cholerae productor de la toxina del cólera B, realizado a escala de laboratorio y de producción.

Se desarrollaron un conjunto de modelos de predicción para biomasa en biorreactores, glucosa y acetato utilizando espectroscopía NIR, basados en la identificación espectral y la regresión PLS, lo que resultó en una alta correlación con los datos de referencia (errores estándar de predicción para biomasa, glucosa y acetato fueron 0.20 gl−1, 0.26 gl−1 y 0.28 gl−1).


Se integró un algoritmo de compensación para las perturbaciones en el biorreactor aireado en el cálculo del modelo, lo que mejoró especialmente la predicción del modelo de biomasa.

En primer lugar, los datos de NIR se aplicaron junto con los datos en línea de EN seleccionados por análisis de componentes principales (PCA) para generar una representación de trayectoria del cultivo por lotes alimentado.
Se demostró una correlación entre la progresión del cultivo y las señales de la Nariz Electrónica (EN), lo que resultó beneficioso para monitorear la calidad del cultivo.

Se mostró que una desviación del comportamiento normal del cultivo podía ser fácilmente reconocida y que la trayectoria podía alertar sobre una contaminación bacteriana. En segundo lugar, los datos de NIR indicaron el potencial de predecir la concentración de la toxina del cólera formada con un error de predicción del modelo de 0.020 g l−1.

En tercer lugar, la predicción en línea de la biomasa basada en el modelo NIR se utilizó para controlar la formación de acetato en el metabolismo de desbordamiento de la cultura de V. cholerae. El controlador comparó la tasa de crecimiento específica real, estimada a partir de la predicción, con la tasa crítica de crecimiento para la formación de acetato y, a partir de esa diferencia, ajustó la velocidad de alimentación de glucosa.

Estos cinco ejemplos están todos relacionados con la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT), ya que aprovechan la operación en línea y utilizan conocimientos científicos sobre la cultura que se aplican en cálculos simples. Sin embargo, los parámetros del proceso derivados no son los más necesarios con urgencia.

Esto indica que hay una necesidad apremiante de aumentar la correspondencia entre los esfuerzos de investigación científica y las necesidades industriales relacionadas con PAT. Los requisitos metodológicos, tanto en términos instrumentales como en acceso a capacidad de modelado, parecen existir. Sin embargo, aún faltan validaciones exitosas de soluciones viables y rentables.

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Sensores de temperatura en biorreactores de alimentación por lotes para la estimación de la tasa de crecimiento

En la imagen, dos sensores de temperatura en biorreactores miden la temperatura del medio de enfriamiento de entrada y salida con un cultivo de Escherichia coli que produce una proteína recombinante. Un tercer sensor mide la temperatura de un cultivo dentro del biorreactor.

Las señales se utilizan en un conjunto de balances energéticos para estimar en línea la tasa de crecimiento específica durante toda la fase de alimentación por lotes. La alimentación de medios se controla a partir del valor estimado de 𝜇 en relación con un valor establecido de 𝜇. La figura muestra un detalle de un diagrama de control donde la alimentación se ajusta mediante un controlador PI para mantener el valor de 𝜇.


La estimación de 𝜇 puede convertirse fácilmente en concentración de biomasa. La ventaja de esta configuración es que la instrumentación con sensores de temperatura en biorreactores ya está presente; solo es necesario adquirir las señales e implementar el algoritmo.


La desventaja de este enfoque es que no solo el crecimiento genera calor en un cultivo de biorreactor, sino también la agitación, la aireación y la titulación. En consecuencia, esto debe compensarse correctamente. Si el calor metabólico es pequeño, la precisión se ve afectada.


Aplicando un filtrado secuencial de señales digitales, el sensor virtual se volvió más robusto para la práctica industrial con cultivos que generan bajo calor metabólico en entornos con niveles elevados de ruido. La señal estimada de la tasa de crecimiento específica obtenida a través del filtro secuencial de tres etapas permitió la alimentación controlada del sustrato durante la fase de alimentación por lotes del proceso de producción.


Las estimaciones de biomasa y tasa de crecimiento del sensor virtual también se compararon con una sonda de sensor en línea de capacitancia para las mismas variables. La comparación mostró una sensibilidad similar o mejor y una menor variabilidad para el sensor virtual de calor metabólico, lo que sugiere que el uso de sensores de temperatura en biorreactores permanentes, es una alternativa realista y económica para la monitorización y el control. Sin embargo, ambas alternativas son fáciles de implementar tanto en un sensor virtual solo como en paralelo.

Así, el estudio demuestra cómo el modelo de estimación puede implementarse como un sensor virtual en un software estándar de control de computadora, en paralelo con otras funciones de sensores virtuales, demostrando así un alto grado de operabilidad en entornos típicos de laboratorio o producción a pequeña escala.

Los resultados también muestran que el modelo del sensor virtual con la función de filtrado es comparable, e incluso mejor, que los sensores de hardware en línea alternativos para la concentración de biomasa y la tasa de crecimiento específica.


Titulación ácida-base para estimar la tasa de crecimiento en un biorreactor por lotes.

Se asume que existe una correlación directa entre la producción de H+ (iones hidrógeno) por parte de las células y el crecimiento. Por lo tanto, se registra el tiempo de funcionamiento de la bomba y la señal del electrodo de pH para el cultivo. Un algoritmo sencillo convierte las señales en biomasa. Si la suposición es correcta y no ocurren otros procesos generadores de H+ en el cultivo, la relación se mantiene.

Sin embargo, si el medio tiene una composición desconocida de aminoácidos, la correlación es más compleja. El ejemplo en la figura se toma de un cultivo donde el medio está definido. La correlación entre la muestra de referencia de biomasa y las estimaciones es alta en la región investigada. Nuevamente, la ventaja con el sensor virtual es que no se requiere ninguna instrumentación auxiliar; el sensor virtual se implementa directamente utilizando las señales existentes en un algoritmo agregado en el software de control del sistema del biorreactor.

El estudio se amplió con sensores de temperatura en biorreactores virtuales adicionales basados en datos en línea estándar de procesos de fermentación y modelos para otras variables de estado en procesos de alimentación por lotes de E. coli: la concentración de biomasa, la tasa de crecimiento específica, la capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor y el nuevo sensor RO/S, que es la relación entre el consumo de oxígeno y el sustrato energético. La variable RO/S crece continuamente en un cultivo de alimentación por lotes con alimentación constante de glucosa, lo que refleja la creciente demanda de mantenimiento con una tasa de crecimiento específica decreciente. El sensor RO/S también respondió a cambios rápidos en el pH, reflejando la creciente demanda de energía para el mantenimiento. Se sugiere que este sensor puede utilizarse para monitorear el grado de estrés fisiológico que demanda energía para la supervivencia.

Este estudio muestra que modelos simples pueden ser utilizados para obtener información adicional a partir de las variables estándar registradas en el proceso de fermentación. Las aplicaciones pueden ser tanto para la caracterización del proceso fuera de línea, como en este estudio, o para el control de retroalimentación en línea. Esto último aumenta la demanda de datos de medición primarios o la necesidad de filtrado de datos en línea. Los sensores pueden ser bastante sensibles a errores en los datos de entrada bajo ciertas condiciones, pero esto genera un error sistemático en los valores de salida y no debería impedir su uso para monitorear cambios en el rendimiento del proceso.

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Estrategia para Utilizar Sensores Virtuales en Biorreactores

Una estrategia para utilizar sensores virtuales en biorreactores como herramientas de PAT debería basarse en el equilibrio entre las necesidades del usuario y las limitaciones de los sensores virtuales, como se discutió anteriormente.

Una clasificación del rendimiento analítico frente a los requisitos del usuario podría ser la manera eficiente de seleccionar la configuración de sensor virtual más relevante. Esto debería implicar, en algún nivel, también una evaluación económica.

Una evaluación del rendimiento analítico en comparación con los requisitos del usuario podría ser la forma eficiente de seleccionar la configuración de sensor virtual más relevante. Esto debería incluir, en algún nivel, también una evaluación económica.

Los sensores supervisan el estado de las células, su número o viabilidad, los metabolitos o proteínas circundantes producidos por las células, componentes del medio de crecimiento añadido ya sea en fase líquida o gaseosa del reactor. En algunos casos, el monitoreo está motivado tanto antes como después de la unidad, en otros solo después o en la unidad.

En (d), el ejemplo con tres unidades secuenciales, se monitorea la conversión gradual en el procesamiento. La estrategia de utilizar sensores virtuales en biorreactores también se puede extender a configuraciones aguas abajo; las configuraciones ilustradas en (e)-(g) muestran cómo los dos flujos de efluentes reflejan la eficiencia de la separación lograda en la unidad.

Los objetivos principales de utilizar las señales del sensor en estos ejemplos son reflejar la pureza del producto principal a nivel celular, proporcionar señales para acciones de control y supervisar la eficiencia del proceso para aprovechar las materias primas o alertar cuando se necesita iniciar una acción de control o un cambio en el proceso.

La utilidad de estos parámetros del proceso es evidente cuando se trata de la toma de decisiones. Esto puede basarse en reflejar un estado metabólico o fisiológico, que es crucial para cambiar las operaciones del proceso y que tiene un efecto directo en la productividad, calidad o eficiencia en el uso de las materias primas.

Estudios previos con sensores virtuales en biorreactores han ejemplificado y demostrado una variedad de alternativas. Estas alternativas deben ser evaluadas y comparadas desde una perspectiva estratégica y en relación con criterios de aplicación.

Una configuración típica de biorreactor a escala de laboratorio proporciona señales en tiempo real para varios parámetros operativos como temperatura, presión, tasa de aireación, pH y pO2. Un biorreactor bien equipado también puede contar con un analizador de gases y un sensor de densidad celular como estándar.

Aplicaciones de Sensores Virtuales en Biorreactores

Las configuraciones de los sensores virtuales en biorreactores en estos ejemplos promueven la estrategia de optimizar la productividad, mejorar la reproducibilidad y reducir la variación de calidad. Y se logra mediante la combinación de sensores en línea y conocimiento científico.

Espectrometría de fluorescencia en línea para estimar los componentes del medio en un biorreactor.

Las concentraciones de biomasa, glucosa y etanol se predicen a partir de espectros escaneados analizados por modelos PLS segmentados. Los modelos de predicción fueron calibrados con datos estándar de proceso en línea y mostraron un bajo error cuadrático medio de predicción (RMSEP) para etanol y glucosa, correspondiente al 4%, 2% y 2% de los respectivos intervalos de concentración.

Estos cultivos de biorreactores por lotes se realizaron utilizando Saccharomyces cerevisiae a concentraciones de biomasa altas (con 190–305 g/L de glucosa) y bajas (con 21–25 g/L de glucosa), utilizando el método de fluorescencia de longitud de onda múltiple y sensores de monitoreo estándar. Se calibraron modelos de mínimos cuadrados parciales para predecir el peso seco celular en tanques de acero, el etanol y la glucosa consumida, utilizando los dos tipos de datos por separado.

Las cultivaciones de baja densidad consistieron en dos fases diaúxicas (captación de glucosa con producción de etanol seguida de captación de etanol después del agotamiento de la glucosa), lo que requirió modelos diferentes para las dos fases, pero mejoró significativamente las predicciones.

Los modelos de predicción calibrados con datos estándar del proceso en línea mostraron RMSEPs similares o más bajos en comparación con los modelos de fluorescencia. Los mejores modelos de predicción para cultivaciones de alta densidad tuvieron RMSEPs de 1.0 g/L de biomasa celular (CDW), 1.8 g/L de etanol y 5.0 g/L de glucosa consumida, correspondientes al 4%, 2% y 2% de las concentraciones, mientras que los modelos de baja densidad tenían 0.3 g/L de CDW, 0.7 g/L de etanol y 1.0 g/L de glucosa consumida, correspondientes al 4%, 8% y 4% de las concentraciones.

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Algoritmos en los sensores blandos en biorreactores

Los algoritmos en los sensores blandos utilizan modelos y métodos de cálculo más o menos complejos. Los enfoques más comunes son los modelos basados en análisis de datos multivariados (MVDA).

La interpretación de datos analíticos en biorreactores o señales de espectrometría NIR y MIR, fluorometría, espectrómetros de masas y narices electrónicas [así como la combinación de datos de diferentes técnicas analíticas] son ejemplos de instrumentaciones de hardware donde se aplican con éxito métodos de MVDA.

Los instrumentos espectrométricos en los que los datos se superponen en espectros actualizados continuamente y donde las señales espectrales se desconvolucionan en conjuntos de variables de estado analíticas son especialmente atractivos como sensores blandos.


Una aproximación de modelo alternativa y popular al análisis de datos multivariados (MVDA) es la red neuronal artificial (ANNs, por sus siglas en inglés).

Se requieren extensas calibraciones y ajustes para sintonizar los parámetros en los modelos MVDA y ANN según la situación de medición real, por ejemplo, la cultura, el entorno del medio y los analitos.

Sin embargo, las técnicas MVDA y ANN son flexibles en su uso y podrían proporcionar muchas alternativas para predecir datos relevantes para los objetivos de la Tecnología de Análisis de Procesos (PAT).


Los algoritmos basados en modelos mecanicistas a veces son la elección preferida debido a su adherencia a eventos y procesos biológicos reales, y al hecho de que los datos analíticos son más fáciles y en su mayoría posibles de relacionar con modelos teóricos aceptados en la bioingeniería.

Típicamente, los algoritmos se derivan de balances de masa y ecuaciones cinéticas para los sistemas biológicos que pueden implementarse fácilmente en el sensor blando con un trabajo bastante limitado.

Los esfuerzos más exigentes serán determinar los valores de los parámetros en los modelos a partir de datos experimentales.

A menudo, los usuarios de sensores blandos no quieren ser obstaculizados por esto y, por lo tanto, prefieren los modelos no deterministas al vincular entradas y salidas según funciones de peso o factores polinómicos.

Desafortunadamente, esto puede resultar en que eventos o rutas metabólicas críticas puedan quedar ocultos en un conjunto de factores numéricos derivados únicamente de experimentos de calibración y entrenamiento.

No obstante, los métodos de mínimos cuadrados parciales (PLS) y las redes neuronales artificiales (ANN) son métodos de modelado comunes que se han aplicado con frecuencia en sensores blandos.

Esto es evidente en casos como narices electrónicas y lenguas electrónicas, donde los sensores de gas y las señales de electrodos sensibles a iones se utilizan como entradas para los modelos PLS o ANN vinculados a salidas como concentraciones de analitos en el medio, biomasa o proteínas expresadas.

Lo mismo se ha logrado con éxito con frecuencia con espectros de masa y ópticos.

Las combinaciones de enfoques de modelado también son alternativas interesantes, como modelos híbridos, así como otras opciones, como algoritmos genéticos y métodos de inferencia.

A veces, las tareas de cálculo para los sensores blandos son sencillas y directas, por ejemplo, sumar, restar, multiplicar o dividir dos valores de señal, como cuando se convierten tasas volumétricas a tasas específicas, se calculan factores de rendimiento o se filtra el ruido.

Aunque bastante simples de implementar, esta información puede tener un gran valor para la comunicación del operador, la toma de decisiones y como puntos de referencia de control.

La validación del rendimiento del sensor blando es un paso muy crítico para la evaluación de su utilidad en la fabricación. Por lo general, los conjuntos de datos de calibración se separan de los datos de validación y se aplican métodos estadísticos y criterios de rendimiento.

Depende del usuario decidir estos criterios y el nivel de las estimaciones del sensor blando que es suficiente para su propósito. En modelos de PLS y ANN, los procedimientos estándar de validación están ampliamente descritos y normalmente se siguen.

En modelos mecanicistas, las correlaciones con métodos de referencia confiables para las variables estimadas son fundamentales.

Las pautas de validación del proceso de las autoridades regulatorias son útiles y aplicables a la validación de sensores blandos.

También se ha sugerido considerar procedimientos de autovalidación incorporados en el sensor blando.

Un comentario general es que depende de las preferencias del usuario elegir un enfoque.

Puede ser que en gran medida el conocimiento del proceso necesario para establecer un modelo mecanicista esté disponible y que los parámetros del modelo estén previamente determinados para las condiciones o el espacio de diseño o control actual.

En ese caso, puede resultar atractivo utilizar ese modelo en el sensor blando. Sin embargo, puede haber muy poco conocimiento previo, lo cual podría ser el caso, por ejemplo, en productos de terapia celular u otros sistemas biológicos complejos. Esto favorecería el uso de modelos de PLS o ANN en el sensor blando.

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Alternativas de sensores de hardware en biorreactores.

Obviamente, los dispositivos detectores de sensores (en un sensor virtual a menudo referido como el «sensor de hardware») que entregan las señales a los algoritmos son los componentes decisivos del sensor virtual; si no cumplen con los criterios necesarios, especialmente en sensibilidad y robustez, el sensor virtual no logrará cumplir su propósito. Los sensores de hardware deben ser capaces de cumplir con los objetivos de la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT) de hardware en biorreactores y, cuando se combinan con un algoritmo de sensor virtual, proporcionar datos analíticos de calidad suficientemente buena. Lograr las necesidades de fabricación depende en gran medida de la capacidad y rendimiento del hardware.


Los sensores virtuales también presuponen la detección en tiempo real, normalmente realizada por dispositivos en línea o en línea, ya sea de manera invasiva o no invasiva. Si esto no es posible, y esto ocurre a menudo en el caso de parámetros biológicos críticos, deben considerarse otras soluciones y estrategias.


Los criterios y objetivos analíticosde hardware en biorreactores como la facilidad de uso, desechable, tiempo de respuesta (justo a tiempo), precisión y precio, deben compararse, evaluarse y clasificarse. Si esto resulta imposible, por ejemplo, debido al tipo de datos biológicos que deben estar disponibles para inferir información útil para las decisiones del proceso (control de retroalimentación, acciones secuenciales, etc.), se requiere una estrategia de monitoreo más refinada.


Varias alternativas de sensores cumplen con los criterios de bajo costo, así como con la robustez y confiabilidad. Desafortunadamente, estos sensores no proporcionan los parámetros más críticos del proceso biológico. Sin embargo, son muy esenciales para mantener condiciones físicas y químicas del hardware en biorreactores en el bioproceso, como temperatura, presión, electrodos de pH y pO2. Además, pueden proporcionar señales que son valiosas para integrar en algoritmos de sensores virtuales.

Varios de los sensores son estándar en equipos de procesos existentes. En parte, esto se puede atribuir a la confiabilidad, durabilidad, estabilidad y bajo precio de estos sensores. Otras alternativas comunes de bajo costo son los analizadores de gases  y métodos de varilla de inmersión para metabolitos y componentes nutritivos. Estos últimos aún no están disponibles comercialmente para uso en línea, pero podrían realizarse técnicamente.
Algunos de los sensores de bajo costo son ideales para los sensores virtuales. Varios sensores de hardware en biorreactores también presentan un rendimiento analítico bueno a muy bueno en cuanto a sensibilidad y estabilidad, mientras que otros, como los electrodos, pueden requerir recalibración debido a la obstrucción y otros efectos de deriva.

La cromatografía líquida de alto rendimiento en línea y la espectrometría de masas en línea son ejemplos de instrumentos independientes más caros con la capacidad de proporcionar datos en línea para proteínas, metabolitos u otros compuestos de bajo peso molecular. Estos métodos son más costosos de configurar en combinación con sensores virtuales, requieren un soporte significativo y vigilancia por parte del operador, pero podrían, en muchos casos, suministrar datos de proceso confiables y valiosos en un corto período. En esta categoría, también encontramos otras alternativas en línea, como sondas capacitivas, sensores calorimétricos, narices electrónicas y lenguas electrónicas. Estos instrumentos son opciones exigentes para los sensores virtuales, a veces lo suficientemente precisos pero menos robustos de usar.


Los métodos espectrométricos en línea, como el NIR, MIR, Raman y la espectrometría de fluorescencia multionda, requieren extensas calibraciones y validaciones de las configuraciones de sensores virtuales para la predicción precisa de los componentes en los medios de proceso. Sin embargo, estos métodos tienen la ventaja de una respuesta rápida. Si los medios de proceso no son demasiado complejos, se pueden esperar señales puras y buenas predicciones, especialmente para moléculas pequeñas. Esto puede ser difícil en medios de biorreactores, pero en el procesamiento aguas abajo, por ejemplo, el NIR y la fluorescencia pueden mostrar una alta reproducibilidad y, por lo tanto, son alternativas viables incluso a gran escala.

Los sensores específicos de células pueden abordar parámetros importantes del proceso, como la morfología, el tipo de célula y los biomarcadores en la superficie celular, pero suelen ser difíciles de implementar de manera online. Esto incluye la microscopía, que normalmente requiere técnicos capacitados en microscopios, pero donde se están desarrollando microscopios automatizados para uso in situ en biorreactores. Además, los citómetros de flujo han mostrado interesantes posibilidades de aplicación en línea con modelos de sensores virtuales PLS. Es importante destacar que estas alternativas de hardware son particularmente importantes para considerar en el monitoreo de la fabricación de células madre o productos de terapia celular.

Métodos más exclusivos para biorreactores, como la resonancia magnética nuclear (NMR) en línea y la resonancia de plasmones superficiales mediante imágenes (imaging SPR), se consideran aquí como demasiado caros e irrealistas para justificar su aplicación en la etapa actual para soft sensors.

La aplicabilidad de la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT) de las alternativas de hardware disminuye en las categorías de alto costo, aunque la relevancia biológica de los datos analíticos puede ser buena. El desarrollo adicional de sensores contribuiría a expandir la zona aplicable de PAT en la tabla. Es especialmente deseable calificar aquellos sensores de hardware con una alta relevancia biológica para un posible uso en PAT.

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Diseño conceptual de sensores blandos para biorreactores

Los sensores blandos para biorreactores en el diseño de sistemas analíticos de procesos, desde una perspectiva de PAT (Proceso Analítico en Línea) o cualquier otro punto de vista, rara vez comienza con un análisis exhaustivo de las necesidades reales del fabricante.

Sin embargo, este debería ser el primer paso a seguir, como comúnmente se hace con otras tareas de diseño de ingeniería.
Las necesidades del fabricante de sensores blandos para biorreactores datos analíticos están básicamente vinculadas a los objetivos básicos de producción: (i) alta o definida calidad del producto y (ii) asegurar el costo de producción más bajo posible.

Como consecuencia, las necesidades de los sistemas analíticos de procesos están guiadas por estos dos objetivos.

Por las mismas razones, los objetivos de PAT se superponen en gran medida con estos.

Con esto como punto de partida, es muy probable que el fabricante mencione el análisis de la pureza del producto y la capacidad de medir subproductos y otras impurezas en tanques de acero que puedan surgir como necesidades de alto nivel; pero también, en qué etapa de la fabricación, con qué precisión, rapidez, frecuencia y con qué esfuerzo se analizan estos.

También es importante en cuanto a sensores blandos para biorreactores, aclarar cómo el fabricante desea utilizar la información analítica.

ser para retirar un lote de calidad demasiado baja, tomar decisiones sobre cómo o cuándo continuar el procesamiento en un paso posterior del proceso, o utilizar la información analítica para el control automático del proceso.

Un tema muy importante para el fabricante es que pueda confiar en el equipo analítico. Principalmente, esto se basa en la precisión, exactitud y repetibilidad de los datos analíticos.

Si se logra eso, el fabricante está dispuesto a aceptar un costo más alto para la instrumentación, al menos hasta que no incremente drásticamente el costo de producción.

Normalmente, los gastos en análisis de los sensores blandos para biorreactores no son tan altos en comparación con el costo total de producción.

Sin embargo, procedimientos analíticos demasiado extensos en un proceso pueden opacar otras rutinas operativas en la fabricación.

Debido a eso, se prefieren análisis que tengan demandas logísticas menores.
Las necesidades de otros fabricantes están directamente relacionadas con la economía del proceso y el tiempo de procesamiento.

Esto podría incluir el análisis de la utilización de las materias primas para garantizar que prevalezcan condiciones óptimas en las etapas del proceso aguas arriba, o que los rendimientos del producto no se pierdan en las etapas de procesamiento aguas abajo.

Para dicha información analítica, el propósito suele ser poder ajustar las condiciones del proceso de inmediato mediante acciones de control.

Aunque las razones detrás de estas necesidades están relacionadas con la economía del proceso, los motivos de PAT son indirectamente posibles de derivar, como el ahorro de materiales y energía.
A un cierto nivel, el fabricante debe volverse específico del producto y debe estar directamente conectado al caso del producto real.

La producción, por ejemplo, de una proteína bioterapéutica en un cultivo de células mamíferas es diferente de un proceso de producción microbiana y, por lo tanto, tiene requisitos analíticos diferentes.

La creación de células para terapia celular difiere considerablemente de un proceso de cultivo celular para una proteína bioterapéutica.

La generación de vectores para terapia génica tiene un diseño de proceso que se desvía de otros procesos de varias maneras.

Cuando las necesidades analíticas se proporcionan con valores objetivo, se puede establecer un mapa mucho más preciso de las necesidades del fabricante.

Esto permite clasificar la importancia de las necesidades analíticas, lo que facilitaría el diseño del sistema analítico.

Con el apoyo del mapeo, se establecen los límites para el diseño del sistema analítico. Una vez hecho esto, se pueden considerar seriamente enfoques de sensores blandos.

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