Sensores y muestreo en biorreactores

La radiación 𝛾 puede afectar en gran medida las propiedades de los Sensores y muestreo en biorreactores, especialmente las del material con características ópticas.

Aunque varios proveedores proporcionan sensores y muestreo en biorreatores de valor de pH y OD basados en tecnologías de detección óptica, aún existen limitaciones y restricciones para su aplicación.

La validez de las mediciones del valor de pH de los sensores ópticos se limita principalmente a un rango entre 6,5 y 8,5, que es suficiente para la mayoría de los procesos de cultivo celular.

Sin embargo, para los procesos microbianos, este rango puede considerarse muy estrecho.

Aparte del rango aplicable limitado, también la no linealidad de la curva de calibración y su desplazamiento después de la radiación 𝛾 pueden crear limitaciones en las aplicaciones de estos sensores.

Se están realizando avances en la aplicación de sensores y muestreo en biorreactores de pH electroquímicos más bien tradicionales o sensores de pH electroquímicos secos modificados, que pueden resistir la radiación 𝛾 y el almacenamiento en seco a largo plazo.

Varios sistemas ópticos o enzimáticos están integrados en matraces de agitación y otros dispositivos de un solo uso, como la tecnología PreSens y los sensores C-CIT.

Además de los parámetros estándar, también se aplicaron sensores y muestreo en biorreatores para medidas de impedancia, que determinan la capacitancia de las células.

La vitalidad celular es un parámetro adecuado para estimar el crecimiento y la productividad.

Los dispositivos se pueden acoplar a celdas de flujo continuo.

Los electrodos también se pueden unir a la superficie de la bolsa.

Se aplicaron medidas de radiofrecuencia no invasivas para estimar la temperatura y, lo que es más importante, la conductividad.

Nacke y col. describió la aplicación de un sensor de espectroscopia de microondas adecuado para la monitorización continua de los medios de fermentación en SUB.

Entre las frecuencias de 300 y 10 GHz, la permitividad y la conductividad se determinaron de forma no invasiva mediante la integración de una ventana dieléctrica como puerto mecánico.

Una posición adecuada de los sensores es esencial en biorreactores agitados.

Una solución es introducir el elemento sensor a través de un tubo de silicona desde la parte superior de la bolsa del biorreactor.

Sin embargo, el sensor puede secarse o flotar en la parte superior del fluido cuando se monta de tal manera, lo que interrumpirá la señal de medición.

Otra solución es ubicar un sensor en el fondo de la bolsa.

Para evitar que el sensor se seque cuando el líquido flota hacia el costado de la bolsa, el sensor se puede ubicar en una pequeña “taza” de medición, que está montada ligeramente debajo de la película plástica inferior de la bolsa.

El líquido permanece en la taza durante el movimiento de la bolsa, incluso con volúmenes de operación muy bajos.

El líquido de la taza se refresca durante el ciclo de movimiento.

El llamado «conector estéril » se utiliza para muchos SUB agitados. Se puede montar un sensor tradicional en el biorreactor en condiciones estériles.

Sin embargo, los sensores y muestreo en biorreactores deben esterilizarse en autoclave con anticipación.

Una ventaja de usar un conector de este tipo en combinación con sensores de biorreactores tradicionales es que también se pueden usar transmisores y sistemas de control establecidos y validados.

Una desventaja importante es que el sensor, en este caso, no está hecho para un solo uso y los procedimientos de validación deben realizarse en su lugar.

Para el muestreo, se utilizan muchos sistemas diferentes, incluidos conectores de muestra, donde una jeringa estéril se puede conectar a bolsas de muestreo estériles completamente preparadas.

Se han desarrollado mecanismos y herramientas para realizar muestreos libres de células mediante el uso de sistemas de membranas, que también son aplicables en biorreactores esterilizables.

Al aplicar tales métodos, también es posible una detección enzimática de glucosa y lactato.

Por tanto, los dos compuestos, que son de mayor interés durante un proceso de cultivo celular, pueden monitorizarse en línea en los SUB.

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Bolsas desechables para biorreactores de un solo uso

El componente principal de los biorreactores de un solo uso son las bolsas desechables. Producidas principalmente a partir de tipos especiales de películas de polietileno, estas bolsas sirven como la cámara de reacción real. El material está en contacto con las células, los medios y el producto.

Los tipos de bolsas modernos se producen con películas multicapa, que en su mayoría se coextruyen utilizando diferentes tecnologías de extrusión (película soplada, película fundida, laminación, etc.). Los tipos modernos de bolsas desechables para biorreactores de un solo uso se producen con películas multicapa, que en su mayoría se coextruyen utilizando diferentes tecnologías de extrusión (película soplada, película fundida, laminación, etc.). La capa de contacto es en la mayoría de los casos un material de tipo polietileno (baja densidad, LDPE; baja densidad lineal, LLDPE; alta densidad, HDPE; densidad media, MDPE o ultrabaja densidad, ULDPE). Además, se aplican mezclas de estos materiales de PE o EVA (copolímero de etileno y acetato de vinilo) como material de capa de contacto. La capa de producto debe poseer características favorables con respecto a los extraíbles y lixiviables (discutidos más adelante). Como capa exterior se aplican materiales con una alta termoestabilidad (para soldadura) y buenas propiedades mecánicas (resistencia a la perforación, caída de dardos, resistencia a la tracción), incluyendo PA (Nylon6) y PET. Este material muestra buenas propiedades de barrera contra el oxígeno, el vapor de agua, el sabor, el olor y los disolventes, respectivamente.

Por lo general, se realizan varias pruebas mecánicas para garantizar el correcto funcionamiento de la película de la bolsa. Estas pruebas incluyen la investigación de la resistencia al agrietamiento, la resistencia a la tracción, la resistencia a la perforación, las pruebas de impacto de dardos y la resistencia al desgarro, entre otras. Todas estas pruebas se describen en protocolos de prueba uniformes y estandarizados (ASTM, ISO). Además, las investigaciones físicas, como las pruebas de resistencia al O2, CO2 y al vapor de agua, se realizan con base en métodos de prueba adecuados y estandarizados.

Para los productos biofarmacéuticos, la ausencia de materiales potencialmente tóxicos es crucial. Instituciones reguladoras como la EMA (Europa) y la FDA de EE. UU. (EE. UU.) Han publicado directrices. Se requiere que el equipo de producción «no presente ningún peligro para el producto» y que los materiales no sean «reactivos, aditivos o absorbentes». En las industrias, es una práctica común que el proveedor de las bolsas desechables para biorreactores de un solo uso o equipos realice evaluaciones y validaciones para confirmar la ausencia de extraíbles2) y lixiviables3) para garantizar la seguridad del producto. Aunque el nivel de lixiviables, que se originan en el biorreactor, detectado en el fármaco final es bastante bajo y el producto suele ser purificado de forma intensiva, la industria es consciente de los posibles problemas y no asume ningún riesgo al respecto.

Para probar los materiales correctamente, se han desarrollado varios procedimientos de prueba, incluido el almacenamiento de soluciones de valor de pH bajo, neutro y alto, así como etanol puro. Se aplican métodos de extracción con solventes y cromatografía de gases (GC / MS) para identificar componentes cruciales volátiles y semivolátiles. Los componentes no volátiles generalmente se identifican mediante procedimientos certificados de cromatografía líquida. La prueba de los materiales es responsabilidad de los proveedores y requiere habilidades analíticas adecuadas. 

Es importante tener en cuenta que todas las pruebas deben realizarse después de la radiación 𝛾 a niveles> 40 kGy (preferiblemente hasta 50 kGy) y también después del envejecimiento de las bolsas (un mínimo de 4 meses).

Para ahorrar costos de validación y minimizar riesgos, la industria prefiere la aplicación de un solo tipo de material de película a lo largo de todo el proceso, que incluye bolsas de preparación y almacenamiento de medios, bolsas de protección y bolsas de productos farmacéuticos (intermedios).

Antes de que el proveedor libere las bolsas desechables para biorreactores de un solo uso para las entregas regulares, las bolsas también se someten a pruebas. Se realizan pruebas como la resistencia del sellado, la verificación visual, la prueba de partículas y la prueba de integridad (prueba de sobrepresión) para cada lote de bolsas de acuerdo con métodos uniformes (ASTM, USP, ISO). Periódicamente se realizan pruebas de carga biológica y endotoxinas bacterianas. Durante la radiación 𝛾 de las bolsas, se realiza un control de la dosis para garantizar que todas las bolsas hayan estado expuestas a un nivel mínimo de radiación (> 25 kGy) y no estén expuestas a un nivel muy alto de radiación (<45 kGy).

Aunque la esterilización por óxido de etileno se aplica en la industria médica, la esterilización por radiación 𝛾es el método de elección en la industria biofarmacéutica. Una gran ventaja es que la esterilización no deja residuos. Siempre que se garantice una dosis mínima (> 25 kGy), se asegura la esterilidad total. Para reducir el nivel de carga biológica y el nivel de partículas antes de la esterilización, las bolsas desechables para biorreatores de un solo uso se fabrican en salas blancas de la clase 10000. La combinación del nivel de dosificación y el nivel máximo de carga biológica está ampliamente aceptada y ha sido validada.

Una de las principales desventajas de los métodos de radiación ionizante (radiación 𝛾, 𝛽) es que todos los materiales tienen que ser resistentes a 𝛾. Esta restricción limita la elección de materiales que se pueden aplicar para el procesamiento estéril. El polietileno, que se usa comúnmente como material de película y como material para construir pilares de conexión, entre otros, puede oxidarse debido a la radiación 𝛾 en presencia de oxígeno durante la esterilización. Los materiales como el etileno-acetato de vinilo copolimerizado o los elastómeros de poliolefina poseen mejores características de resistencia a 𝛾.

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Biorreactores de un solo uso, diseño, aplicaciones y desarrollo.

Los biorreactores de un solo uso, durante la última década,  se han introducido con éxito en los procesos de producción y desarrollo de procesos biofarmacéuticos. 

Los biorreactores de un solo uso están hechos de una bolsa de plástico, que está montada sobre una plataforma vibratoria o está rodeada por una carcasa para estabilizar su forma cuando se opera a alta presión.

Las dos partes en su conjunto sirven como un biorreactor, que más o menos mantiene las mismas características que los biorreactores tradicionales de tanque agitado, aunque existen limitaciones en las tasas de transferencia de masa de oxígeno alcanzables y los tamaños de cultivo.

Para lograr una cierta estabilidad de las bolsas de plástico, se suelen aplicar tipos especiales de películas de polietileno de alta densidad.

Todas las conexiones se realizan con tubería flexible; Los filtros desechables garantizan la esterilidad y los sensores también son desechables en la mayoría de los casos.

Las bolsas se esterilizan mediante radiación 𝛾. Por lo tanto, ya están preesterilizados en el sitio donde se realiza el cultivo.

Las bolsas se pueden vaciar después de su utilización antes del procesamiento posterior y se desechan.

Los biorreactores de un solo uso se clasifican en función de la tecnología de mezcla empleada, por ejemplo, (i) los biorreactores fijados en revestimientos de tanques (con varias construcciones para el dispositivo agitador) se denominan «agitados», (ii) los fijados en un agitador longitudinal se denominan «mezcla de ondas”, y (iii) los biorreactores de un solo uso conectados a un agitador orbital se denominan“ sacudidos orbitales ”.

Son varias las ventajas de los SUB, especialmente relevantes en la producción biofarmacéutica y los correspondientes procedimientos de certificación y validación, que reducen el esfuerzo administrativo en el sitio de producción.

Estos son principalmente la eliminación de los requisitos de limpieza, la rapidez de respuesta, la flexibilidad y la reducción de los riesgos de contaminación (cruzada).

Además, dado que no se necesita esterilización con vapor in situ, se requieren menores costos operativos y de inversión. Esto permite un aumento más rápido de la capacidad sin inversiones masivas.

Por lo tanto, la restricción de tamaño (el volumen máximo de SUB todavía está limitado a muy pocos metros cúbicos) puede contrarrestarse mediante la paralelización, aunque la viabilidad y la viabilidad económica deben investigarse caso por caso.

Los factores negativos, que se observaron durante los primeros años de aplicación de los biorreactores de un solo uso, como el riesgo de rotura de materiales plásticos y la migración de lixiviables y extraíbles, han perdido relevancia debido a la mejora de materiales y diseño de los equipos.

Sin embargo, a veces estos problemas aún pueden ocurrir y son objeto de mayor investigación y desarrollo.

Se ha entrevistado a líderes de la industria para indicar el grado (porcentaje) en el que los procesos (parte ascendente) se basan en la aplicación de tecnología de un solo uso en un estudio realizado por Langer.

Aunque en la producción comercial todavía se utilizan ampliamente equipos de acero inoxidable (en función de la capacidad instalada anteriormente y, por lo tanto, ya existente antes de la introducción de la tecnología de un solo uso), los biorreactores de un solo uso son claramente dominantes en los procesos de producción de material clínico.

Desde la introducción de la tecnología de «olas» en la década de 1990, se han introducido varios tipos de biorreactores.

Aunque, en primera instancia, solo se utilizaron biorreactores de tipo oscilante, los sistemas de agitación, que incluyen un eje desechable y palas agitadoras, se han vuelto cada vez más importantes.

Hasta la fecha, los sistemas agitados están disponibles en tamaños de 20 a 2000l, y algunos usuarios seleccionados han introducido sistemas aún más grandes como sistemas beta.

Los sistemas de tipo balancín están disponibles en tamaños con volúmenes de trabajo de <1 l hasta algunos cientos de litros.

También se aplican diseños de biorreactores alternativos, como sistemas de agitación orbital y sistemas híbridos, donde se utilizan burbujas de aire para lograr la mezcla.

Además, especialmente para aplicaciones de laboratorio, también están disponibles recipientes de policarbonato con volúmenes de trabajo de 100 ml hasta 15 l.

Recientemente, la aplicación de material de un solo uso en el rango de microlitros y mililitros bajos se está volviendo más importante como biorreactores.

El mayor grado de paralelización se obtiene en una placa de micropocillos. Sin embargo, apenas pudo interpretar esto como un biorreactor en las primeras versiones introducidas al mercado.

El propósito tampoco era la aplicación de cultivos microbianos. Sin embargo, desde entonces, nuevos desarrollos abrieron posibilidades para aplicar estas tecnologías de un solo uso para el cultivo a pequeña escala.

La mayoría de los SUB introducidos hasta ahora solo se aplican para procesos basados en cultivos de células de mamíferos.

Como los procesos microbianos (aeróbicos) normalmente requieren una entrada de energía al menos diez veces mayor para la mezcla y la transferencia de masa entre la fase líquida y gaseosa que los procesos de mamíferos, los SUB actuales no son adecuados para crear tales condiciones.

Aproximadamente el 40% de todos los productos biofarmacéuticos que se encuentran en la Fase III de desarrollo clínico se basan en procesos microbianos.

Se trata de una amplia variedad de productos, como proteínas terapéuticas y de diagnóstico, proteínas terapéuticas de bajo peso molecular, vacunas humanas y veterinarias y muchos otros productos.

Por lo tanto, también existe una fuerte demanda de equipos de un solo uso, que sean aplicables a procesos microbianos, ya que las ventajas de usar SUB también tienen en cuenta este tipo de procesos.

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Producción de proteínas recombinantes y estrategias de expresión.

El uso de sistemas de expresión inducibles (regulados) en la producción de proteínas recombinantes se ha señalado como una herramienta clave para minimizar la carga metabólica. Esto permite separar la fase de crecimiento (estado reprimido) de la fase de producción (estado inducido).

Es importante destacar que los procesos de alimentación por lotes de HCDC permiten tales esquemas de cultivo, incluida la optimización de parámetros como la tasa de crecimiento, el tiempo de inducción, la concentración de inductor, etc. Un principio aplicable genéricamente para minimizar el estrés causado por altos niveles de expresión de proteínas recombinantes es reducir la tasa de transcripción permitiendo así que la traducción y el plegamiento de proteínas recombinantes se desarrollen más lentamente.

Por ejemplo, esto se ha logrado en E. coli limitando la cantidad de inductor (por ejemplo, IPTG) suministrado al proceso o reduciendo la temperatura. Un nivel de inducción fisiológicamente tolerable permite un período de formación de producto prolongado y, por lo tanto, se puede obtener una mayor concentración específica de producto al final del proceso. En tales condiciones, se minimiza el estrés relacionado con el plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas durante la fase de inducción.

Se ha informado que las temperaturas de crecimiento reducidas aumentan la producción de proteínas recombinantes en varios organismos hospedadores, incluidas bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Los análisis proteómicos del efecto de la temperatura en cultivos de quimiostato de P. pastoris recombinante revelaron que el estrés de plegamiento generalmente disminuye a temperaturas de cultivo más bajas, lo que permite una secreción de proteínas heterólogas más eficiente.

Además, este estudio sugirió que la reducción de la demanda de plegamiento y degradación de proteínas también podría conducir a una menor demanda de energía. Además, la implementación de cultivos de P. pastoris en lotes de alimentación con temperatura limitada permitió reducir drásticamente los valores de muerte celular y la proteólisis de proteínas.

Además de la temperatura, las tasas de síntesis de proteínas también están moduladas por la tasa de crecimiento, por lo que se debe realizar un estudio cuidadoso de la relación entre la producción de proteínas recombinantes y la tasa de crecimiento específica.

En general, la selección de estrategias de cultivo que permitan prolongar la fase de producción y minimizar la inducción de respuestas al estrés es clave para obtener altos rendimientos de proteína recombinante.

Dado que el plegamiento y la secreción de proteínas se ven afectados por múltiples factores ambientales, incluida la temperatura, el pH, la osmolaridad y el estrés oxidativo, así como los parámetros de cultivo como la composición del medio, el tiempo de inducción, la concentración del inductor y la tasa de crecimiento, dicha selección puede llevar mucho tiempo.

La combinación de sistemas de microrreactores de alto rendimiento que se mencionan aquí, combinada con el monitoreo en línea de los marcadores de estrés, puede ofrecer una herramienta poderosa para el rápido desarrollo de estrategias de cultivo por lotes alimentados que minimizan el estrés y maximizan la producción de proteínas recombinantes.

Por ejemplo, las proteínas de fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) se han utilizado como indicadores para seleccionar estrategias de alta densidad celular de E. coli que minimizan el estrés (es decir, un mayor plegamiento de proteínas que da como resultado una señal de fluorescencia más alta), incluido el inductor de optimización (IPTG) concentración, punto de inducción, temperatura y composición del medio de crecimiento.

De manera similar, se ha informado de un enfoque basado en GFP fusionado a un promotor sensible al estrés para el monitoreo del estrés en línea en E. coli que también debería permitir una rápida selección de las condiciones óptimas de producción.

Consideraciones de diseño de biorreactores para minimizar el esfuerzo de corte.

Los efectos de la tensión causados por las fuerzas de cizallamiento debidas a la agitación mecánica en el reactor podrían requerir una atención especial. Esta es, en particular, la situación con las células de mamíferos cuando se cultivan en biorreactores de tanque agitado a gran escala.  Estas células son muy sensibles al esfuerzo cortante. Esta propiedad impone una serie de limitaciones específicas sobre el diseño y el funcionamiento de los biorreactores de células animales, ya que está bien establecido que el cizallamiento puede dar como resultado la muerte celular o respuestas fisiológicas no letales.

Además, en el caso de celdas dependientes del anclaje, es necesario proporcionar un material de soporte con una relación de superficie grande, por lo que estas celdas generalmente se fijan en microportadores. Por lo tanto, la elección de las condiciones de agitación en este tipo de proceso tiene que mantener las células (o microvehículos) en suspensión completa y medio de cultivo homogeneizado, al tiempo que se limitan las restricciones mecánicas generadas por la hidrodinámica en las células.

También se han desarrollado biorreactores de membrana y métodos de microencapsulación para el cultivo celular simultáneo, la concentración de producto y la eliminación de subproductos tóxicos. Muchos de estos sistemas se comportan como sistemas de perfusión, donde las células se retienen en el reactor, el medio se agrega de forma continua o semicontinua y el medio gastado (que contiene metabolitos tóxicos) se elimina.

Las células de mamíferos en un biorreactor de tanque agitado están sujetas a esfuerzos cortantes o turbulencias dentro de la fase líquida, así como a fuerzas cortantes asociadas con la interfaz gas-líquido. El esfuerzo cortante asociado a líquidos puede resultar en muerte celular (necrosis), apoptosis celular y respuestas fisiológicas no letales. Este último puede afectar las funciones celulares, la fisiología, el contenido de superficie de los receptores celulares, los niveles de producción de proteínas recombinantes e inducir la apoptosis. Estos cambios pueden tener un impacto en la tasa de crecimiento, la productividad y la calidad del producto.

Para reducir el daño por cizallamiento a las células de mamíferos en el biorreactor, se han diseñado impulsores de bajo cizallamiento, como hidroalas de paletas anchas de bombeo hacia abajo o hacia arriba y impulsores de “oreja de elefante”. Además, en comparación con los procesos de fermentación microbiana, la entrada de energía normalmente recomendada para el cultivo celular es extremadamente baja.

La inmovilización en perlas de gel (alginato, colágeno, poliacrilamida), la microencapsulación de células de mamíferos y el uso de tales sistemas en una configuración de lecho fluidizado o empaquetado también pueden minimizar los efectos de cizallamiento en las células, así como mejorar la productividad. Se han implementado reactores basados en agitación inducida por olas con aireación en el espacio de cabeza, es decir, biorreactores de olas, para diferentes sistemas de células en volúmenes de reactor de hasta 200 l. En estos reactores, se ha informado que el esfuerzo cortante en condiciones de aireación es insignificante para el daño celular.

Las células en la interfaz gas-líquido son susceptibles de dañarse, ya que la rotura de las burbujas de aire es particularmente destructiva para las células que se acumulan en la interfaz de una burbuja de gas y el medio. Muchos agentes protectores de cizallamiento como Pluronic F-68 se utilizan comúnmente para evitar que las células se acumulen en la interfaz gas-líquido.

Otros aditivos como polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), celulosas derivatizadas (metocelas), dextranos, etc., también pueden minimizar el daño hidrodinámico de las células. Cuando se utilizan protectores de cizallamiento, el burbujeo de gas es el método más simple y aceptable para el intercambio de gases. No obstante, las líneas celulares difieren en la sensibilidad al cizallamiento. Por ejemplo, varias líneas celulares de importancia industrial, como las células CHO, ampliamente utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, son relativamente insensibles al daño celular.

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Mejora del suministro de energía para la producción de proteínas.

Las plataformas de fábricas de células microbianas tales como E. coli y levadura pueden cultivarse hasta densidades celulares elevadas utilizando un medio definido con, por ejemplo, glucosa o glicerol. Sin embargo, los altos niveles de producción de proteínas imponen una mayor demanda de aminoácidos. Esto implica una mayor demanda de síntesis de aminoácidos de novo, es decir, precursores biosintéticos de aminoácidos y energía requerida. La suplementación directa de aminoácidos al medio de crecimiento da como resultado títulos de proteínas recombinantes más altos en E. coli. De manera similar, varios estudios han informado una mejora en la producción de proteínas en diferentes cepas prototróficas de levadura que crecen en medios definidos al complementarlas con aminoácidos específicos. Coherentemente, los medios ricos en complejos tienen un efecto positivo significativo sobre la producción de proteínas recombinantes, como se muestra para varias levaduras.

La expresión de alto nivel de proteínas heterólogas y su secreción también provocan un aumento de la demanda de energía, que es suministrada por el metabolismo del carbono central, lo que da lugar a importantes redistribuciones del flujo metabólico. Se ha demostrado que el uso de sustratos de carbono auxiliares, es decir, la utilización simultánea de dos sustratos distintos, aumenta los rendimientos de crecimiento en varias levaduras, muy probablemente porque la cantidad de energía disponible de los sustratos es mayor cuando las células se cultivan en la mezcla de sustratos. que cuando se cultivan en cada fuente de carbono individualmente. Se ha demostrado que el uso de sustratos mixtos estimula la producción de proteínas recombinantes en la levadura. La suplementación de acetato con medios mínimos de glucosa o glicerol de Schizosaccharomyces pombe recombinante que secreta una proteína modelo (maltasa) en cultivos de quimiostato aeróbico mejoró la secreción de proteínas. La co-alimentación de acetato permitió un mayor flujo de carbono a través del ciclo de TCA, así como una mayor producción de NADPH mitocondrial.

De manera similar, se ha demostrado que la suplementación de P. pastoris recombinante que crece en metanol con sorbitol o glicerol aumenta la productividad de las proteínas recombinantes en biorreactores de tanques de acero inoxidable. Por lo general, los cultivos de P. pastoris recombinante de alta densidad celular en lotes alimentados basados en el promotor AOX (alcohol oxidasa) regulado por metanol tienen tres fases: una fase de lote de crecimiento que utiliza glicerol como fuente de carbono, seguida de una fase de lote de transición con glicerol mezclado / alimentación de metanol, y la fase de inducción en la que se utiliza metanol como única fuente de carbono. El punto clave para maximizar la productividad y minimizar la carga metabólica del bioproceso es la fase de inducción. Algunos estudios han sugerido que la carga de energía de adenilato de P. pastoris se ve afectada por la expresión de proteínas recombinantes en condiciones inductoras de metanol. En particular, Plantz et al. informó que la carga de energía (CE) cayó de 0,75 (justo después de la transición del lote de glicerol a la fase de inducción de metanol) a 0,6 al final de la fase de alimentación de metanol, principalmente debido a una disminución constante de ATP y el aumento concomitante de ADP a lo largo de esta fase. Esta observación se correlacionó con una disminución en la tasa de producción específica de proteína recombinante.

Dado que las reservas de adenilatos influyen en la síntesis y secreción de proteínas, estos estudios apoyan la hipótesis de que el metanol como única fuente de carbono no puede sostener las demandas de carbono y energía para sostener tanto el crecimiento como la producción de proteínas secretadas recombinantes durante períodos prolongados. Por el contrario, los cultivos de quimiostato en estado estable de glucosa / metanol mezclados fueron capaces de mantener niveles estables de secreción de proteína recombinante, correlacionados con valores de CE altos y estables de aproximadamente 0,9. Esto podría explicar los niveles mejorados de productividad observados en cultivos de lotes alimentados de P. pastoris utilizando estrategias de alimentación de fuentes de metanol / multicarbonos, es decir, mediante el uso de sustratos mixtos se pueden mantener altos niveles de CE a lo largo de toda la fase de producción.

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Metabolismo por desbordamiento y la toxicidad del sustrato

Como se discutió en artículos anteriores, la acumulación de acetato en el cultivo de E. coli, el principal producto del metabolismo por desbordamiento de este organismo, está principalmente relacionada con la tasa de crecimiento específica y la tasa de absorción de sustrato (glucosa).

Las altas tasas de consumo de glucosa específica (qs) promueven la formación de acetato, independientemente de la disponibilidad de oxígeno en el cultivo.

El acetato tiene un efecto inhibidor tanto sobre el crecimiento de la biomasa como sobre la síntesis de proteínas, así como sobre la respuesta general al estrés.

Bajo la limitación de glucosa, el valor de qs está directamente relacionado con la tasa de crecimiento específica (siempre que no haya otro nutriente limitante además de la glucosa).

Por lo tanto, las estrategias de cultivo por lotes que controlan la alimentación de nutrientes son muy eficientes para prevenir el metabolismo por desbordamiento o evitar la subalimentación que causa períodos transitorios de inanición, así como para minimizar las alteraciones metabólicas causadas por la inducción de la expresión de proteínas.

Las estrategias de alimentación más simples pueden involucrar la aplicación de tasas de alimentación constantes, mayor alimentación (paso a paso) o tasas de alimentación exponenciales sin control de retroalimentación (es decir, control de circuito abierto).

Este último generalmente permite que las células crezcan a una tasa de crecimiento específica constante al alimentar con glucosa (u otra fuente de carbono) como un nutriente que limita el crecimiento.

De esta manera, la formación de acetato puede minimizarse o incluso evitarse controlando la tasa de crecimiento específica por debajo de un cierto valor umbral, que puede variar según la cepa y el medio de crecimiento, pero típicamente oscila entre 0,15 y 0,35 h − 1.

En particular, las estrategias de alimentación exponencial permiten mantener la concentración de glucosa en el caldo de cultivo en valores cercanos a cero sin fluctuaciones, minimizando así las perturbaciones en el metabolismo por desbordamiento celular.

Alternativamente, existen métodos de alimentación de nutrientes con control de retroalimentación: los métodos de pH-stat o DO (oxígeno disuelto) -stat se basan en el monitoreo en línea de los cambios en el pH o el DO, donde una alimentación de nutrientes se activa cuando el pH o el OD aumentan según la fuente de carbono que controla el crecimiento se agota.

Estos métodos de alimentación controlados por retroalimentación tienden a ser conservadores, es decir, dan como resultado una tasa de crecimiento por debajo del umbral para la producción de acetato.

Esta ventaja ha hecho que estas estrategias se utilicen ampliamente para la HCDC de E. coli.

S. cerevisiae, una levadura fermentativa (positiva para Crabtree), produce etanol a altas concentraciones de glucosa, incluso en presencia de oxígeno.

Por lo tanto, se han desarrollado estrategias similares de alimentación por lotes (es decir, limitar la alimentación de glucosa) para esta fábrica de células.

En particular, aunque la producción de proteínas en la industria se basa generalmente en cultivos de alimentación por lotes debido al riesgo de inestabilidad genética y contaminación de cultivos continuos, la insulina es producida en S. cerevisiae por Novo Nordisk en cultivo continuo.

Las levaduras Crabtree-negativas como P. pastoris ofrecen a priori la ventaja de una producción reducida de subproductos (principalmente, etanol y arabitol).

En el caso de las células de mamíferos, el cultivo por lotes está limitado por el agotamiento de nutrientes (principalmente glucosa y glutamina) y la acumulación de metabolitos tóxicos (principalmente lactato y amonio), lo que resulta en la muerte celular.

Los sistemas microbianos, se han desarrollado procesos alternativos de perfusión y alimentación discontinua para superar este inconveniente.

La alimentación controlada de glucosa y glutamina se ha utilizado ampliamente en cultivos de células de hibridoma y otras líneas celulares, utilizando sistemas de bucle de control abiertos o cerrados.

En cuanto a la formación de subproductos también se ve afectada por la composición del medio de cultivo.

Por ejemplo, se ha demostrado que la sustitución de la glucosa por otras fuentes de carbono como la manosa o la fructosa, o la combinación de glucosa con aminoácidos en el medio de alimentación reduce el acetato y aumenta el rendimiento de proteínas.

Además, se ha demostrado que el glicerol es superior a la glucosa en la reducción de la formación de acetato durante la fase de inducción de proteínas recombinantes de las HCDC de E. coli.

También se ha demostrado que el reemplazo de glucosa por glicerol en la fase discontinua del cultivo de fermentación discontinua alimentado con P. pastoris reduce la formación de subproductos (etanol y arabitol).

También se ha demostrado que el reemplazo de glucosa por glicerol en la fase discontinua del cultivo de fermentación discontinua alimentado con P. pastoris reduce la formación de subproductos (etanol y arabitol).

La sustitución de glucosa por galactosa y glutamina por glutamato produce una redistribución del flujo metabólico que conduce a tasas más lentas de formación de lactato y amonio en células de mamíferos.

Esencialmente, tanto la galactosa como el glutamato se metabolizan a una velocidad más lenta (es decir, lo que da como resultado velocidades de crecimiento celular más bajas), minimizando así la formación de subproductos.

La combinación de este enfoque con la reformulación cuidadosa de la composición de aminoácidos del medio de crecimiento en cultivos de células CHO alimentados por lotes resultó en una mayor viabilidad del cultivo, longevidad y producción de proteínas.

En general, aunque los métodos controlados por lotes alimentados proporcionan medios eficientes para prevenir el metabolismo por desbordamiento, no existe un protocolo o regla general para seleccionar la estrategia de alimentación óptima para lograr la máxima productividad de una proteína determinada.

En este contexto, los sistemas de microrreactores de alto rendimiento (p. Ej., Basados en placas de microtitulación agitadas) que proporcionan condiciones de mezcla y transferencia de gas similares a las que se encuentran en los biorreactores convencionales, además de incorporar dispositivos de monitoreo y control activo, ofrecen una poderosa herramienta para la alimentación por lotes. proceso de desarrollo.

Además, estos sistemas se pueden combinar con sistemas enzimáticos de liberación lenta de glucosa (u otro sustrato limitante), ampliando la gama de estrategias de alimentación de sustrato, por ejemplo, en E. coli y levadura.

En algunos casos, el sustrato puede ser tóxico incluso a concentraciones relativamente bajas.

Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de P. pastoris utilizando los sistemas de expresión inducibles por metanol clásicos requiere un control cuidadoso del sustrato inductor.

La alta concentración de metanol en el caldo de cultivo provoca un efecto inhibidor sobre el crecimiento que afecta drásticamente la productividad del proceso.

Durante la oxidación del metanol se generan especies reactivas de oxígeno, como el peróxido de hidrógeno y otras moléculas peroxidadas, que deben eliminarse para minimizar el daño celular.

De hecho, se ha informado que la catalasa, que elimina el peróxido de hidrógeno, y una glutatión peroxidasa o peroxiredoxina, que elimina las moléculas peroxidadas, aumentan fuertemente en la fase discontinua alimentada con metanol de los cultivos de P. pastoris, concomitante con el aumento del recambio de peroxisomas.

El estrés oxidativo causado por el metanol puede aliviarse mediante la adición de antioxidantes como el ácido ascórbico.

Además, las estrategias de alimentación de metanol, en particular para las células de fenotipo Mut + (utilización de metanol), es decir, las células con la capacidad de asimilación de metanol de tipo salvaje, deben tener en cuenta los altos requisitos de consumo de oxígeno y el considerable calor generado por el metabolismo por desbordamiento del metanol a altas temperaturas. densidades celulares.

En estas condiciones, la capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor a menudo es incapaz de mantener la demanda metabólica de oxígeno.

Las estrategias clásicas y más simples de alimentación de metanol están asociadas con un control de oxígeno disuelto DO-stat, manteniendo un nivel mínimo alrededor del 20%.

Aunque se han desarrollado diferentes estrategias de control de DO-stat [157], el metanol no se monitoriza y la acumulación del sustrato podría ser la causa de la inhibición del crecimiento.

Aunque se han desarrollado diferentes estrategias de control de DO-stat, no se controla el metanol y la acumulación del sustrato podría ser la causa de la inhibición del crecimiento.

Alternativamente, la limitación de oxígeno se ha aplicado con éxito para controlar la absorción de metanol durante la fase de inducción (es decir, el nutriente limitante es oxígeno en lugar de metanol), lo que permite una mejora en la producción y evita la alta demanda de oxígeno dentro de los tanques de acero inoxidable.

En particular, se han aplicado estrategias de lotes alimentados con oxígeno limitado (OLFB) a la producción de anticuerpos monoclonales en cepas de P. pastoris modificadas por glicoingeniería utilizando la tasa de absorción de oxígeno como parámetro de escalamiento.

También se ha informado que OLFB reduce la lisis celular y aumenta la calidad del producto final, además de prolongar la fase de producción de la proteína objetivo.

Otra estrategia común para controlar los niveles de metanol es el control 𝜇-stat.

Se obtiene un perfil de velocidad de alimentación de metanol exponencial preprogramado a partir de ecuaciones de balance de masa en una estrategia clásica de control de bucle abierto.

En esta estrategia, el cultivo siempre se realiza en condiciones limitantes de metanol en cuanto al metabolismo por desbordamiento.

El éxito de la tasa de crecimiento específica óptima depende de la naturaleza de la proteína diana, pero es un enfoque simple muy fácil de implementar.

Se ha aplicado con éxito con diferentes proteínas en los biorreactores, obteniendo generalmente la mejor producción a bajas tasas de crecimiento específico.

Sin embargo, esta no es una regla general en el metabolismo por desbordamiento.

Por ejemplo, esta estrategia resultó en rendimientos y productividades muy bajos al producir una lipasa recombinante de Rhizopus oryzae, que se sabe que desencadena el UPR.

Todas las estrategias para el control del metanol descritas hasta ahora tienen el problema potencial de que la concentración de metanol no se mide en línea.

El metanol puede sufrir fluctuaciones a lo largo de la fase de inducción afectando negativamente la productividad del bioproceso.

Por tanto, se han desarrollado diferentes estrategias de control de circuito cerrado de metanol para evitar este problema.

En general, la productividad máxima se obtiene en el rango de 2-4 g -1 de metanol.

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Metabolitos Indicadores y su Monitoreo

La concentración de componentes del medio y metabolitos indicadores secretados por las células como azúcares, aminoácidos y subproductos (acetato, etanol, lactato, etc.) se puede cuantificar típicamente mediante métodos de HPLC, proporcionando información útil sobre el metabolismo de la célula.

Además, las tecnologías de sondeo in situ basadas, por ejemplo, en métodos basados en espectroscopía y análisis ópticos pueden proporcionar información sobre los cambios del estado fisiológico que resultan de la producción de proteínas.

Sin embargo, la interpretación o asignación de cambios de señal a parámetros relacionados con la fisiología no es sencilla.

Además, se han establecido métodos para la monitorización de metabolitos indicadores como el tetrafosfato de guanosina (ppGpp), la molécula de señal central del sistema de respuesta estricto en bacterias, y el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), una molécula señal implicada en la represión de metabolitos.

Esto ha permitido estudiar la correlación entre los niveles de expresión de genes recombinantes o el contenido de plásmidos de la célula y los niveles de concentración de estos metabolitos indicadores, arrojando información valiosa sobre la interrelación entre la producción de proteínas recombinantes y el estado fisiológico.

La cuantificación de los grupos intracelulares de ATP, ADP y AMP también es otra fuente de información sobre la impartición metabólica de la síntesis y secreción de proteínas recombinantes, ya que los grupos de adenilatos influyen directamente en estos procesos celulares que consumen energía.

Como ejemplo, la producción de proteína recombinante en E. coli usando promotores fuertes inducibles por temperatura causó una caída transitoria de la carga de energía de adenilato (AEC = [ATP + 1 / 2ADP] / [ATP + ADP + AMP]) – un indicador de la estado energético de las celdas, justo después del aumento de temperatura en los tanques de acero inoxidable.

Por el contrario, se ha informado de una disminución sostenida de AEC a lo largo de la fase de inducción de metanol de HCDC de P. pastoris cuando se usa el promotor AOX inducible por metanol en los biorreactores.

El análisis global del metabolismo de la célula huésped por medio de plataformas analíticas ómicas como transcriptómica, proteómica, metabolómica y fluxómica ahora se puede utilizar para investigar el efecto fisiológico tanto de las tensiones ambientales como de la biosíntesis recombinante, guiando la identificación de posibles dianas metabólicas para la ingeniería celular. , selección de condiciones de crecimiento y estrategias de cultivo que favorezcan la producción de proteínas recombinantes, o identificación de genes marcadores sensibles al estrés.

En particular, estas herramientas analíticas se han utilizado cada vez más para caracterizar los cambios fisiológicos globales en bacterias, principalmente en E. coli (revisado por Carneiro et al.) Y Bacillus sp., Así como en sistemas hospedadores eucariotas, incluyendo levaduras, hongos filamentosos, y células de mamíferos.

En general, el diseño de estrategias de cultivo orientadas a alcanzar rendimientos máximos de proteína recombinante suele seguir el principio de selección de modos de cultivo que permiten prolongar la fase de producción, a tasas de crecimiento controladas, así como minimizar la inducción de eventos de estrés.

Por lo tanto, es importante ajustar la tasa de producción de proteína recombinante, la capacidad del metabolismo de la célula huésped y las condiciones de cultivo, minimizando así los posibles cuellos de botella en el metabolismo.

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Monitoreo del estrés y cambios fisiológicos y la carga metabólica

El seguimiento de los cambios fisiológicos de los procesos de producción de proteínas recombinantes es la clave para la comprensión de los procesos y sistemas y, por lo tanto, la clave para el diseño y la optimización racionales de los bioprocesos en biorreactores con tanques de acero inoxidable.

La caracterización del impacto metabólico durante los procesos de producción de proteínas recombinantes a menudo se puede realizar mediante la estimación de parámetros y cambios fisiológicos clásicos, como los rendimientos de crecimiento, las tasas de crecimiento específicas máximas, así como el consumo específico de sustrato o las tasas de producción específicas de subproductos.

Estos indicadores se basan en la medición de variables como la concentración de biomasa, el consumo de oxígeno y las tasas de producción de CO2 o la concentración de sustratos y subproductos.

No obstante, estos parámetros no revelan la extensión y los aspectos mecanicistas de los cambios fisiológicos subyacentes.

Además del monitoreo estándar de variables físicas y químicas, una serie de técnicas fuera de línea y dispositivos de monitoreo de procesos en línea permiten estimar y medir parámetros y cambios fisiológicos como la viabilidad celular, producto recombinante, así como metabolitos indicadores u otros componentes celulares que responden a la adaptación fisiológica de las células a la expresión de proteínas recombinantes.

Además, la transcriptómica, la proteómica, la metabolómica y la fluxómica también se están utilizando como una herramienta para la comprensión a nivel del sistema de la respuesta celular y la adaptación a la producción de proteínas recombinantes, tanto como base de conocimientos para la mejora racional de la cepa (ingeniería metabólica) como para la identificación del estrés. genes informadores adecuados para la optimización de bioprocesos.

La producción de proteínas recombinantes lleva a las células a estados de estrés y puede conducir a la muerte celular durante el proceso de producción.

La citometría de flujo se ha utilizado ampliamente para determinar la fracción de células muertas mediante tinción diferencial de células con yodo de propidio, desde bacterias y levaduras hasta células de mamíferos.

Mediante la tinción triple con fluorocromo con yoduro de propidio, bromuro de etidio y bisoxonol, es posible discriminar entre células no dañadas, dañadas (membrana despolarizada) y muertas.

La citometría de flujo con una variedad de marcadores fluorescentes también se ha utilizado para estudiar la progresión del ciclo celular y los eventos de muerte celular programada (apoptosis) durante los cultivos de células de mamíferos en biorreactores, que ha demostrado ser una herramienta valiosa para la optimización de estrategias de cultivo y tecnologías analíticas de procesos.

Esta técnica también se puede aplicar para medir una amplia variedad de rasgos metabólicos complejos, por ejemplo, la detección de la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y condiciones redox in vivo.

El plegamiento y la secreción de proteínas oxidativas pueden sobrecargar la capacidad redox del retículo endoplásmico (RE), lo que resulta en la acumulación de ROS y proteínas mal plegadas / desplegadas en este compartimento.

La tinción de ROS se puede lograr típicamente usando diferentes sondas fluorescentes como DHE (dihidroetidio), DHR (dihidrorrodamina 123) y DCF (2 ′, 7′-diclorodidrofluoresceína), mientras que un estudio reciente ha demostrado que las condiciones redox in vivo en el RE y el citosol de las células de levadura puede controlarse dirigiendo variantes de GFP sensibles a redox (roGFP) a los respectivos orgánulos.

El último procedimiento es un ejemplo de un biosensor codificado genéticamente, que no requiere la adición de sustancias químicas exógenas.

Dichos biosensores también pueden diseñarse de tal manera que la expresión de la proteína fluorescente esté bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad está regulada por la señal intracelular de interés, por ejemplo, promotores sensibles al estrés.

Por ejemplo, la señal de fluorescencia de GFP expresada en E. coli bajo un promotor sensible al estrés se puede medir mediante espectroscopia de fluorescencia de longitud de onda múltiple 2D o citometría de flujo, lo que permite el monitoreo de estrés in vivo en línea o en línea, como una alternativa a la medición directa. de los niveles de ARNm de genes de estrés seleccionados.

Los componentes proteicos de superficie e intracelulares (incluidos los cuerpos de inclusión) también se pueden teñir mediante técnicas de inmunofluorescencia para el análisis de citometría de flujo posterior. Para acceder a los objetivos intracelulares, las células se permeabilizan suavemente.

Se han utilizado procedimientos de inmunotinción intracelular para monitorizar y cuantificar la formación de cuerpos de inclusión en E. coli o el producto recombinante retenido en las células y los marcadores UPR como la proteína BiP en levadura.

BiP es un acompañante de la clase HSP70 que juega un papel importante en la respuesta al estrés de las proteínas desplegadas.

De lo contrario, las proteínas de fusión GFP y GFP se pueden usar para correlacionar la fisiología de una sola célula y la población con los niveles de expresión de proteínas recombinantes, lo que proporciona una herramienta valiosa para optimizar las estrategias de cultivo / inducción.

Cabe destacar que la citometría de flujo es compatible con la implementación de análisis multiparamétricos (multiplexados), mejorando la discriminación de estados y cambios fisiológicos, además de proporcionar información valiosa sobre la heterogeneidad fenotípica de una población microbiana.

Además, estos procedimientos pueden automatizarse potencialmente conectando un citómetro de flujo directamente a un biorreactor, ofreciendo una herramienta muy poderosa para monitorear las propiedades fisiológicas de las células microbianas y de mamíferos en condiciones relacionadas con el proceso.

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Expresión de alto nivel de proteínas recombinantes

proteínas recombinantes

Se ha reconocido y documentado desde hace mucho tiempo que la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes heterólogas tiene un impacto directo en el metabolismo del huésped, a menudo afectando negativamente los parámetros de crecimiento como la tasa de crecimiento, el rendimiento de biomasa y la tasa de consumo de sustrato específico, por ejemplo, en bacterias, levaduras, y células de mamíferos.

Estos obstáculos son responsables de limitar la cantidad de proteína extraña que se puede producir a partir del organismo. 

Por un lado, la expresión de genes extraños conduce a un aumento en la transcripción y traducción específicas, que puede llegar a ser limitante a niveles muy altos debido al agotamiento de precursores y energía, como se describe para E. coli.

Además, se ha descrito una carga metabólica relacionada con el mantenimiento del plásmido.

Además, E. coli provoca una respuesta al estrés como resultado de la sobreexpresión de proteínas recombinantes que desencadena la regulación positiva de los genes del estrés, incluidos los genes de choque térmico, chaperona y que codifican proteasas.

En este caso, se ha demostrado que la formación de agregados de productos (cuerpos de inclusión) y productos mal plegados, como resultado de altas tasas de síntesis, es un factor importante.

No obstante, el perfil transcripcional de las respuestas al estrés a la expresión de alto nivel de proteínas en cultivos de alta densidad celular es diferente al de los cultivos de baja densidad celular.

También se ha informado de la carga asociada con la demanda metabólica de síntesis de proteínas recombinantes para la expresión de alto nivel de productos intracelulares en levaduras.

Sin embargo, considerando las productividades específicas moderadas de las proteínas secretadas que a menudo se logran en los sistemas de levadura, las limitaciones en la síntesis, transcripción y traducción de aminoácidos no parecen ser un obstáculo importante.

Aún así, la demanda de energía es significativamente mayor para las proteínas secretadas, ya que el plegamiento, la glicosilación y la secreción son vías que consumen mucha energía.

De hecho, se ha observado una carga metabólica relacionada con la secreción de proteínas en levaduras, incluso a niveles de expresión bajos a medios.

Existe una amplia evidencia de limitaciones en la translocación de la membrana, el procesamiento de la secuencia de señales y el plegamiento dentro del retículo endoplasmático.

Se han descrito respuestas de estrés celular a proteínas desplegadas (respuesta de proteína desplegada, UPR) para levaduras, hongos filamentosos y eucariotas superiores, y se ha demostrado que se desencadenan tras la sobreexpresión de una proteína recombinante secretada, lo que aumenta el metabolismo demanda de los procesos de plegamiento y secreción.

La UPR también está relacionada con la degradación de proteínas a través de la vía de degradación de proteínas asociada a ER (ERAD), un proceso que detecta proteínas mal plegadas y las redirige a la degradación proteasomal en el citosol, actuando como una vía de alivio del estrés.

En este contexto, las mediciones recientes de los flujos intracelulares de proteínas secretadas en levadura utilizando estrategias de marcaje isotópico han revelado que una fracción significativa de la proteína recombinante sintetizada (más del 50%) está realmente degradada.

Además, la UPR regula varios procesos metabólicos como la síntesis de lípidos y aminoácidos, además de regular negativamente la expresión de proteínas secretadas en hongos.

En general, los procesos de plegado, modificación postraduccional y transporte son costosos en términos de energía y bloques de construcción de carbono.

Es importante destacar que la interacción de las tensiones externas (p. Ej., Temperatura, pH, osmolaridad, disponibilidad de oxígeno) y la tensión intrínseca desencadenada por la sobreexpresión de proteínas, en particular por el plegamiento y la secreción, juega un papel importante en las limitaciones fisiológicas de un sistema de producción, que comparten patrones similares entre diferentes clases de fábricas de células.

Limitaciones fisiológicas en cultivos a gran escala

Además, un problema importante en los cultivos microbianos y celulares recombinantes a gran escala es la existencia de condiciones ambientales heterogéneas generadas por biorreactores industriales a gran escala, por ejemplo, temperatura, pH, tensión de oxígeno disuelto o fluctuaciones de concentración de sustrato.

Tales condiciones hidrodinámicas no ideales en biorreactores a gran escala se han estudiado en biorreactores reducidos, que consisten en una parte mixta conectada a una parte no mezclada por una bomba de recirculación, imitando así las condiciones hidrodinámicas encontradas a gran escala.

Se ha demostrado que las condiciones heterogéneas, como los gradientes de sustrato en cultivos en biorreactores a gran escala de E. coli recombinante, reducen el rendimiento celular y aumentan la formación de subproductos, así como la lisis celular, lo que da como resultado la proteólisis del producto.

La concentración de sustrato oscilante y los niveles de oxígeno disuelto condujeron a una disminución de la absorción de glucosa en biorreactores, la formación de etanol y una síntesis de aminoácidos alterada en Bacillus subtilis, mientras que las condiciones limitantes de oxígeno oscilante disminuyeron la tasa de crecimiento específico y aumentaron la formación de subproductos en Pichia pastoris.

Además, las inhomogeneidades en los biorreactores a escala de producción también pueden afectar la calidad del producto en cultivos de células de mamíferos, donde se ha informado que las condiciones heterogéneas en el oxígeno disuelto afectan la N-glicosilación de varias proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos.

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Proteínas recombinantes y la operación de un biorreactor.

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A priori, se pueden considerar tres modos operativos para la producción de proteínas recombinantes, a saber, cultivo discontinuo, discontinuo y continuo en la operación de un biorreactor.

Para la viabilidad económica, cualquier método de cultivo tiene que cumplir con varios criterios, incluyendo alta productividad volumétrica, alta concentración de producto final, estabilidad y reproducibilidad del proceso, sustratos de bajo costo (en el caso de proteínas a granel), así como restricciones legales, para, por ejemplo, los relacionados con la aplicación de tecnología de ADN recombinante.

Los cultivos por lotes generalmente no son adecuados para la producción a gran escala. La alta concentración de sustrato (azúcar) al inicio del cultivo provoca fenómenos de represión de catabolitos. Además, la sensibilidad osmótica de las células (o la toxicidad del sustrato, por ejemplo, cuando se usa metanol como fuente de carbono en sistemas de levadura metilotrófica) impone un límite a la concentración inicial de nutrientes. Además, dado que no se puede controlar la tasa de crecimiento, el cultivo por lotes se ve limitado por el oxígeno en la operación de un biorreactor. Las altas tasas de crecimiento también pueden causar un metabolismo de desbordamiento, lo que lleva a la formación de subproductos, incluso en presencia de oxígeno; por ejemplo, la fermentación alcohólica se desencadena en algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae, la formación de acetato en Escherichia coli o la excreción de lactato y amonio en cultivos de células de mamíferos en la operación de un biorreactor. Además, el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de subproductos conducen a la apoptosis (muerte celular programada) en los sistemas celulares de los mamíferos. Por el contrario, la tasa de crecimiento en cultivos continuos y en lotes alimentados se puede modular mediante la adición controlada de sustrato, evitando así la formación de subproductos y los fenómenos de represión de catabolitos enla operación de un biorreactor, además de permitir la adaptación de la absorción de oxígeno y la generación de calor al rendimiento del biorreactor. Sin embargo, los cultivos continuos prolongados pueden dar como resultado la acumulación de poblaciones de células menos productivas o no productivas y, por lo tanto, una disminución de la productividad.

Como resultado, el cultivo por lotes alimentado es a menudo el modo operativo preferido para la producción a gran escala de proteínas heterólogas. En particular, los procesos de alimentación por lotes se realizan típicamente a una tasa de crecimiento baja cuando se operan en condiciones que limitan el sustrato. Por lo tanto, los efectos de una tasa de crecimiento bajan sobre la fisiología celular y las tasas de formación de productos de las células son de importancia clave y tienen un gran impacto en la productividad específica. Por ejemplo, se pueden provocar respuestas celulares como la falta de nutrientes, contribuyendo así al estrés metabólico de las células huésped. Estudios transcriptómicos recientes en levaduras han revelado que la tasa de crecimiento regula procesos centrales como la síntesis y secreción de proteínas, así como la respuesta al estrés. En particular, una parte sustancial del carbono del sustrato se gasta para satisfacer los requisitos de energía de mantenimiento en condiciones que limitan el crecimiento, como las que se encuentran en los procesos de alimentación por lotes. Los altos requisitos de mantenimiento van a expensas de la biomasa y la formación de productos y, por lo tanto, no son deseables en la producción de proteínas heterólogas. Los requisitos de mantenimiento pueden verse significativamente influenciados por parámetros ambientales como la temperatura, el pH y la composición del medio.

Además, los procesos de producción de proteínas recombinantes se llevan a cabo normalmente en cultivos de alta densidad celular (HCDC) para maximizar los rendimientos espacio-temporales y las productividades volumétricas. En HCDC, las células a menudo sufren varios desafíos fisiológicos, incluida la disponibilidad limitada de oxígeno, la acumulación de dióxido de carbono a niveles que pueden disminuir la tasa de crecimiento y estimular la formación de subproductos (por ejemplo, acetato en E. coli), la generación de calor y la eficiencia de mezcla reducida. Tales tensiones ambientales en HCDC de lotes alimentados no ocurren simplemente como respuestas transitorias a cambios repentinos (choque), sino más bien como una adaptación a largo plazo de las células productoras a condiciones subóptimas. De hecho, las células están expuestas a una limitación de energía progresivamente creciente, experimentando una mayor muerte y lisis celular, segregación en estados viables, pero no cultivables y perfiles transcripcionales alterados a altas densidades celulares. Por lo tanto, la inducción de la expresión de proteínas recombinantes bajo estas condiciones de estrés «basal» impone un estrés intrínseco adicional superpuesto al sistema.

Una complicación adicional en huéspedes procarióticos como E. coli son los mecanismos de detección de quórum, es decir, los sistemas de señalización intercelular reguladores del crecimiento en los que una molécula de señal extracelular soluble que, al alcanzar una concentración crítica en el medio, permite la activación sincrónica de la respuesta a nivel de población, por ejemplo, en respuesta a un estrés ambiental o limitación de nutrientes. DeLisa y col. demostraron que E. coli comunica el estrés o la carga impuesta por la acumulación de proteína heteróloga. Se han descrito varios mecanismos similares a la detección de quórum en levaduras. Sin embargo, aún se desconoce cómo estos mecanismos pueden interferir con la producción de proteínas en estos microorganismos.

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