Cromatografía líquida de alta resolución en línea
Cromatografía líquida de alta resolución en línea para la estimación de subproductos de la fermentación mixta de ácidos.
El sensor virtual en la cromatografía líquida utiliza una sonda NIR in situ con una ventana de longitud de onda fija para adquirir una señal de absorbancia que está relacionada con la concentración total de biomasa. Esta señal se combina con datos de un HPLC en línea, donde los picos del cromatograma se analizan para metabolitos seleccionados en el medio, siendo importantes para supervisar el estado metabólico de la cultura de E. coli que expresa la proteína.
Después de la evaluación de las áreas de los picos, los datos de HPLC se convierten en concentraciones de acetato, glucosa, lactato y formiato. Al transformar las señales de HPLC y biomasa a concentraciones específicas (g de metabolito/g de célula por hora), se monitorea el estado fisiológico y se utiliza para determinar la tasa de alimentación en el cultivo por lotes alimentado.
La ventaja en este caso es que la instrumentación en el sensor virtual está bien establecida, y los métodos robustos y el HPLC analizan varios analitos por corrida. La desventaja es el tiempo de espera relativamente largo del HPLC (hasta 25 minutos) en comparación con la sonda NIR, que responde en segundos.
En particular, este enfoque de sensor virtual brinda la oportunidad de controlar el desbordamiento metabólico de la fermentación de ácidos mixtos y el metabolismo de desbordamiento de glucosa en un cultivo por lotes alimentado para la producción de proteína verde de fluorescencia recombinante (GFP) en E. coli.
La parte computacional del sensor virtual utilizó ecuaciones cinéticas básicas y sumas para la estimación de tasas específicas y concentraciones totales de metabolitos. Se evaluaron dos estrategias de control para la alimentación del medio en el cultivo por lotes alimentado: (i) controlar las tasas específicas de metabolismo de desbordamiento y metabolitos de fermentación de ácidos mixtos en valores preestablecidos fijos, y (ii) controlar la concentración de la suma de estos metabolitos a un nivel establecido.
Los resultados indican que la última estrategia fue más eficiente para mantener un alto título y una baja variabilidad de la proteína verde de fluorescencia recombinante producida. El estudio presentado muestra cómo la variabilidad de un producto de proteína recombinante puede reducirse mediante el control basado en un sensor virtual. El sensor virtual reduce la necesidad de instrumentación y análisis fuera de línea. El principal objetivo de la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT, por sus siglas en inglés), de aumentar la estabilidad del proceso y reducir la variabilidad de los parámetros clave del proceso, en particular el título del producto, se puede lograr con el enfoque del sensor virtual.
Además en la cromatografía líquida, se puede observar que el controlador no debe ser muy preciso (es decir, mostrar una rápida declinación, pequeños fallos estacionarios) para lograr una baja variabilidad en realidad.
Además, el resultado del estudio indica que el enfoque de control fisiológico no es necesariamente la estrategia de control más exitosa.
Sin embargo, sería deseable en la cromatografía líquida una mayor simplificación de la configuración del sensor virtual. Si un menor número de sensores de hardware puede lograr la estrategia de control, se mejoraría la aplicabilidad industrial y se reducirían aún más el mantenimiento y el suministro.
Nariz electrónica y espectroscopía NIR para el control de la producción de toxina del cólera
El NIR y la EN se utilizaron para monitorear y controlar un cultivo por lotes alimentado de Vibrio cholerae productor de la toxina del cólera B, realizado a escala de laboratorio y de producción.
Se desarrollaron un conjunto de modelos de predicción para biomasa en biorreactores, glucosa y acetato utilizando espectroscopía NIR, basados en la identificación espectral y la regresión PLS, lo que resultó en una alta correlación con los datos de referencia (errores estándar de predicción para biomasa, glucosa y acetato fueron 0.20 gl−1, 0.26 gl−1 y 0.28 gl−1).
Se integró un algoritmo de compensación para las perturbaciones en el biorreactor aireado en el cálculo del modelo, lo que mejoró especialmente la predicción del modelo de biomasa.
En primer lugar, los datos de NIR se aplicaron junto con los datos en línea de EN seleccionados por análisis de componentes principales (PCA) para generar una representación de trayectoria del cultivo por lotes alimentado.
Se demostró una correlación entre la progresión del cultivo y las señales de la Nariz Electrónica (EN), lo que resultó beneficioso para monitorear la calidad del cultivo.
Se mostró que una desviación del comportamiento normal del cultivo podía ser fácilmente reconocida y que la trayectoria podía alertar sobre una contaminación bacteriana. En segundo lugar, los datos de NIR indicaron el potencial de predecir la concentración de la toxina del cólera formada con un error de predicción del modelo de 0.020 g l−1.
En tercer lugar, la predicción en línea de la biomasa basada en el modelo NIR se utilizó para controlar la formación de acetato en el metabolismo de desbordamiento de la cultura de V. cholerae. El controlador comparó la tasa de crecimiento específica real, estimada a partir de la predicción, con la tasa crítica de crecimiento para la formación de acetato y, a partir de esa diferencia, ajustó la velocidad de alimentación de glucosa.
Estos cinco ejemplos están todos relacionados con la Tecnología de Análisis en Proceso (PAT), ya que aprovechan la operación en línea y utilizan conocimientos científicos sobre la cultura que se aplican en cálculos simples. Sin embargo, los parámetros del proceso derivados no son los más necesarios con urgencia.
Esto indica que hay una necesidad apremiante de aumentar la correspondencia entre los esfuerzos de investigación científica y las necesidades industriales relacionadas con PAT. Los requisitos metodológicos, tanto en términos instrumentales como en acceso a capacidad de modelado, parecen existir. Sin embargo, aún faltan validaciones exitosas de soluciones viables y rentables.