Modelización para monitoreo de bioreactores

En la modelización para monitoreo de biorreactores se toman en cuenta los desafíos introducidos por los datos recopilados de los bioprocesos, en particular la alta dimensionalidad de los conjuntos de datos resultantes, hacen que los enfoques multivariados para la modelización de datos de bioprocesos sean un requisito esencial. El uso de herramientas quimiométricas está bien establecido en otros campos científicos, especialmente en química, aunque su amplia aceptación en la modelización de bioprocesos se evidencia por la gran cantidad de publicaciones que informan sobre el uso rutinario de estas herramientas tanto en la investigación como en las aplicaciones industriales. Se presentan brevemente varios enfoques de modelización multivariada, tanto lineales como no lineales, con énfasis específico en su aplicabilidad para el monitoreo y control de bioprocesos.

A pesar de que el argumento en el monitoreo de biorreactores de utilizar métodos basados en la suposición fundamental de relaciones lineales entre las variables del proceso se cita con frecuencia como una limitación importante de los métodos lineales, estos siguen siendo ampliamente utilizados y aceptados en el análisis y modelado de datos de bioprocesos. A pesar del carácter no lineal de los bioprocesos, se ha demostrado que diversas modificaciones y preprocesamiento de datos permiten que los métodos lineales capturen de manera efectiva las características subyacentes de los bioprocesos modelados.

Extracción de características y clasificación


Uno de los métodos de análisis exploratorio de datos/extracción de características más frecuentemente descritos en la literatura de quimiometría es el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés). Esta técnica de monitoreo de bioreactores se utiliza con frecuencia como un enfoque de reducción de datos, especialmente antes de llevar a cabo un análisis de regresión adicional. Esta capacidad de reducción de datos resulta de la descomposición de la matriz de datos original de las mediciones del proceso (X) en un conjunto de variables no correlacionadas (componentes principales – PCs). Los PCs ortogonales resultantes son una combinación lineal de las variables originales del proceso, con el primer PC capturando la mayor parte de la varianza en los datos originales y los PCs subsiguientes capturando una proporción decreciente de la varianza, respectivamente.

La siguiente ecuación representa esta descomposición en términos de las matrices resultantes de puntajes (T) y cargas (P), y una matriz de error residual (E):

X=TPT +E

Dado que los componentes principales (PCs) se ordenan en función de la disminución de la varianza, es posible capturar las características subyacentes en los datos originales utilizando menos PCs, lo que reduce la dimensionalidad de los datos originales. Esto hace que el PCA sea especialmente adecuado en el monitoreo de biorreactores para el análisis de datos altamente dimensionales producidos por técnicas de huella dactilar y métodos multianalíticos, como técnicas espectroscópicas, narices y lenguas electrónicas, así como la salida de diversas mediciones «ómicas», según confirman numerosos informes en la literatura.

Las fuentes de literatura sobre la aplicación del PCA en el análisis de datos de bioprocesos abarcan una amplia gama de aspectos de los bioprocesos, desde la materia prima, el cultivo de semillas, la producción en lotes o el monitoreo de la calidad del proceso aguas abajo. La funcionalidad del PCA para la reducción de la dimensionalidad de los datos del proceso se utiliza típicamente en todas estas aplicaciones. El conjunto resultante de componentes principales se utiliza típicamente posteriormente como entradas en modelos de monitoreo de procesos dentro de esquemas de control estadístico multivariado de procesos (MSPC).

En una variedad de aplicaciones, el PCA y técnicas similares, como el análisis discriminante lineal/cuadrático/regularizado, los vecinos más cercanos o la agrupación jerárquica, se utilizan como «clasificadores», es decir, asignan muestras/objetos a una de las posibles clases en función de las mediciones recopiladas para la muestra/objeto dada en comparación con una biblioteca de muestras similares recopiladas a lo largo del tiempo. Estas aplicaciones en el monitoreo de biorreactores son particularmente útiles para identificar similitudes, por ejemplo, en datos de expresión génica recopilados a través de una variedad de microarrays de ADN/ARN o patrones en datos de metabolómica. En tales aplicaciones, el problema importante es especificar los criterios para discriminar entre las diversas clases. Los peligros de las decisiones arbitrarias en este sentido son discutidos por Glassey, donde se presenta un estudio de caso sobre el uso del PCA para discriminar entre lotes de producción de anticuerpos monoclonales recombinantes de alta y baja producción utilizando el sistema de expresión de Escherichia coli. Aunque inicialmente la agrupación de componentes principales parecía proporcionar una clasificación razonable para la discriminación requerida, un análisis más profundo reveló que la agrupación inicial arbitraria estaba más relacionada con la composición del alimento que con el título del producto.

En el control de calidad multivariado, típicamente en la industria alimentaria y potencialmente muy importante en la industria biofarmacéutica para asegurar la calidad del producto final, las técnicas mencionadas anteriormente suelen ser menos aplicables. En tales casos, es importante determinar sin lugar a dudas si el producto pertenece a una categoría en particular (por ejemplo, productos alimentarios no adulterados de una región específica). Forina et al. argumentan que esta tarea es más adecuada para las técnicas de modelado de clases (CMT), como UNEQ, SIMCA, POTFUN (modelado de funciones potenciales) y MRM (modelado de rangos multivariados). Estos métodos se discuten luego con más detalle en términos de su capacidad discriminatoria y su sensibilidad al ruido en los datos.

Para contrarrestar el argumento de la limitación de las técnicas de extracción y clasificación de características lineales, se introdujo un gran número de métodos no lineales. Estos no solo incluyen variantes no lineales de las técnicas lineales descritas anteriormente en el monitoreo de biorreactores, sino también técnicas basadas en redes neuronales artificiales, descritas con más detalle por Marini o Glassey. Este último también proporciona ejemplos de aplicaciones de bioprocesos de tales técnicas para identificar el estado fisiológico de la cultura y, por lo tanto, potencialmente mejorar la estimación de importantes parámetros del proceso.

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Monitorización de Bioprocesos

Métodos alternativos de medición multianalito de bioprocesos, como biorreactores con sensores de nariz electrónica y las lenguas electrónicas, también se han utilizado con éxito en la monitorización de bioprocesos.


Estos tipos de enfoques son matrices multisensoriales, que frecuentemente utilizan una variedad de principios de transducción, como electroquímicos, gravimétricos y ópticos, tal como Rudnitskaya y Legin resaltan, junto con proporcionar un resumen de los materiales de detección respectivos y los analitos/aplicaciones.

Una ventaja particular de los biorreactores con sensores de nariz electrónica, frecuentemente destacada en la literatura, es su capacidad para medir analitos volátiles directamente en el espacio de cabeza/gas de salida sin necesidad de contacto directo con el medio de cultivo.

Además, podría haber retrasos temporales, especialmente para analitos de baja concentración, y los sensores podrían verse afectados por la deriva y la interferencia del vapor de agua.

Aunque la lengua electrónica puede requerir cierta preparación de la muestra para eliminar sólidos suspendidos a fin de que el medio líquido entre en contacto con la matriz de sensores.

Varios métodos «ómicos», en esencia, también producen una huella dactilar de las características del organismo o del entorno en el que se cultivan y podrían considerarse métodos de monitorización de huellas dactilares.

Ejemplos de herramientas genómicas, transcriptómicas, proteómicas y metabolómicas utilizadas para la monitorización de bioprocesos y para aumentar la comprensión demuestran el valor agregado que estos métodos pueden ofrecer en el desarrollo y operación de bioprocesos.

Características y Desafíos de los Datos para la Modelización


La diversidad de bioprocesos conduce a una variabilidad significativa en la calidad y cantidad de los datos del proceso medidos.

Como argumentan Vojinovic y colaboradores, las variables del proceso medidas, la frecuencia, la precisión y el retraso temporal se ven afectados por el proceso de fabricación que está siendo monitorizado.

En general, sin embargo, la multitud de métodos analíticos utilizados en la modelización de bioprocesos (consultar secciones anteriores) resulta en una cantidad sustancial de datos continuos y discretos de calidad variable y registrados a diversas frecuencias.

Este problema de la frecuencia variable y la gran cantidad de datos se ve exacerbado por el uso de tecnologías de alto rendimiento, donde el cuello de botella en el desarrollo de procesos se traslada de la disponibilidad de recursos para llevar a cabo los experimentos necesarios al análisis de datos de la gran cantidad de datos resultantes.

Por lo tanto, se requiere un procesamiento de datos significativo para que los datos puedan ser utilizados en el desarrollo de modelos de bioprocesos con fines de monitorización y control.

Este preprocesamiento y conciliación de datos pueden incluir la alineación temporal simple, el relleno de datos faltantes mediante interpolación o el uso de métodos más sofisticados.

Los datos espectroscópicos en particular han demostrado beneficiarse de un preprocesamiento adecuado para reducir las fuentes de variabilidad y ruido en los datos, y mejorar el contenido informativo del conjunto de datos resultante.

Estos métodos de preprocesamiento frecuentemente incluyen el centrado en la media (dado que los espectros se miden en las mismas unidades, esta estandarización suele ser satisfactoria), el uso de derivadas para eliminar el desplazamiento de la línea base o la variación de la pendiente, o diversos métodos de suavizado y corrección de dispersión.

Estos incluyen el suavizado de datos ruidosos mediante un filtro de Savitzky-Golay, la corrección de dispersión multiplicativa (MSC) y la variación normal estándar (SNV).

Uno de los principales desafíos para la modelización multivariante efectiva de datos de bioprocesos con fines de monitorización y control es la fusión de datos de diversas fuentes y con diversas características.

Es posible utilizar diversas representaciones matemáticas de los datos para capturar las características más relevantes de cada etapa del bioproceso, y las metodologías para combinarlas en un marco efectivo capaz de capturar el comportamiento completo del proceso aún no están suficientemente estandarizadas.

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Métodos de medición avanzados en biorreactores

Con el rápido desarrollo de las técnicas analíticas, la categorización de los métodos en tradicionales y avanzados se está volviendo cada vez más arbitraria. Una amplia gama de técnicas consideradas avanzadas en la medición avanzada en biorreactores (al menos desde el punto de vista de la aplicación industrial) ahora se utilizan rutinariamente en el procesamiento de biomoléculas. Muchas de estas técnicas todavía se utilizan predominantemente fuera de línea, es decir, requieren muestreo manual o automático con transferencia de muestras a laboratorios especializados para su análisis. Sin embargo, ya se están aplicando técnicas en línea, frecuentemente in situ, con una sonda colocada dentro de un biorreactor o una operación unitaria desde donde se realiza la medición. El progreso más notable en el monitoreo de los bioprocesos se registró, como era de esperar, en la etapa de la parte aguas arriba (biorreactor). Se puede argumentar que esta etapa es la parte más desafiante del bioproceso desde el punto de vista del monitoreo y control, dada la complejidad del proceso y su impacto potencial en la calidad y cantidad del producto.

Los avances recientes en medición avanzada en biorreactores, particularmente en la tecnología de fibra óptica y el desarrollo de espectrómetros y sondas in situ robustas, hacen que los métodos espectrales de monitoreo de bioprocesos sean especialmente atractivos. En el sector de las bioindustrias, la espectroscopía, en particular la espectroscopía de infrarrojo cercano (NIR), se utilizaba tradicionalmente en la industria alimentaria. En el caso de la espectroscopía NIR, se destacaron características como alta capacidad de procesamiento, tiempo de respuesta corto, base rápida y no destructiva, capacidad de muestreo remoto, poca o ninguna preparación de muestras y la capacidad de proporcionar determinación simultánea de múltiples componentes por medición en tiempo real, especialmente beneficiosas para la industria alimentaria. Estas características son igualmente beneficiosas en otras áreas del procesamiento de biomoléculas.

Existen varios métodos de medición avanzada en biorreactores que se basan en la absorción de radiación en regiones específicas del espectro electromagnético, desde ultravioleta (UV) hasta ondas de radio, y se utilizan en diferentes grados en las bioindustrias. Tamburini y colaboradores describen varias técnicas y analitos medidos por estos métodos en función de la longitud de onda en la que operan. Lourenco y colaboradores ofrecen una visión general exhaustiva del análisis espectroscópico (UV/vis, NIR, infrarrojo medio (MIR), Raman y fluorescencia) en la amplia industria de los bioprocesos, incluyendo el ámbito medioambiental, agroalimentario, de biocombustibles y farmacéutico. Para cada aplicación, se muestran la escala de producción, los detalles del sistema espectroscópico utilizado, así como el método de análisis de datos quimiométricos y el modo de aplicación (monitoreo y control cualitativo/cuantitativo). Aunque la espectroscopía UV/vis, la fluorometría, la espectroscopía Raman y la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) han demostrado ser útiles para el monitoreo de la biomasa, NADH, ATP, glucosa y otros metabolitos, la espectroscopía infrarroja, en particular la NIR, ha encontrado la aplicación más diversa tanto en la investigación como en la industria en las últimas décadas.

a capacidad de detectar grupos que contienen enlaces –CH (ya sean alifáticos, aromáticos o alquenos), –NH y –OH permite la identificación rápida de muestras de bioprocesos en la región del espectro NIR (700-2500 nm) o MIR (2500-40000 nm).

Se informó que la espectroscopía NIR se aplica con éxito de manera rutinaria en la biomanufactura, especialmente en pruebas de calidad de materias primas y productos finales, y de manera más amplia en el monitoreo de bioprocesos para una variedad de analitos en el procesamiento aguas arriba (por ejemplo, para una visión general) o la calidad del producto aguas abajo. La última publicación de medición avanzada en biorreactores fue especialmente útil desde el punto de vista del monitoreo de bioprocesos, ya que demostró la capacidad de la espectroscopía MIR para cuantificar agregados solubles de anticuerpos (se probaron dos anticuerpos diferentes) después de la elución de la proteína A, así como en dos diferentes sobrenadantes de cultivo de células CHO clarificados. Los autores pudieron demostrar una capacidad de predicción satisfactoria hasta el 1% de agregados en comparación con la cantidad total de anticuerpos, con coeficientes de variación inferiores al 20% para la mayoría de las muestras.

Sin embargo, el éxito de la aplicación a menudo se ve influenciado por una serie de factores interferentes, como la agitación, las burbujas de gas, los cambios de temperatura, la alimentación y los cambios en la composición del medio. Por lo tanto, el preprocesamiento adecuado de los datos y los métodos de análisis de datos multivariados son especialmente importantes en estos casos, y se discuten en las secciones siguientes.

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Métodos de medición analítica para el monitoreo de biorreactores

El monitoreo oportuno del comportamiento del proceso no solo es requerido por las pautas de la Tecnología Analítica de Procesos (PAT, por sus siglas en inglés), sino que constituye una base crítica para un control de proceso efectivo. Una revisión detallada de la instrumentación específica del proceso para la medición de parámetros críticos está más allá del alcance de este capítulo, y varios autores ofrecen una revisión útil de técnicas de medición útiles para los bioprocesos en general, ya sea enfocándose en tipos específicos de bioprocesos o tipos de sensores. Independientemente del bioproceso considerado, es importante considerar cuidadosamente las características de los sensores antes de su aplicación en un esquema de monitoreo y control. Estas consideraciones incluyen precisión y resolución, precisión, sensibilidad, confiabilidad, tiempo de respuesta, practicidad, así como el costo. Vojinovic et al. incluyen requisitos adicionales sobre los sensores de bioprocesos in situ, como la capacidad de funcionar sin ensuciamiento durante períodos prolongados de tiempo, soportar condiciones extremas durante la esterilización y tener un rango dinámico que cubra la variación esperada en la variable de proceso medida.

Otras consideraciones para la medición analítica para el monitoreo de biorreactores incluyen la capacidad de generar datos de múltiples analitos sin consumo de analitos y sin interferencia con el metabolismo del cultivo. Dada la amplia bibliografía relacionada con los sensores, la frecuencia de la medición y la disponibilidad de sensores ya existentes, solo se presenta un breve resumen de los sensores más relevantes para los bioprocesos considerados en este libro en las siguientes secciones.

Métodos de medición tradicionales

Sonnleitner ofrece una descripción detallada de varios métodos para monitorear variables físicas y químicas en la medición analítica para el monitoreo de biorreactores, incluyendo mediciones de temperatura, tasas de flujo, pH, pO2, pCO2 y composición de gases. También se incluye una revisión exhaustiva y actualizada de los métodos de biomasa y bioactividad, resaltando los beneficios y los desafíos asociados con los diversos métodos detallados en la revisión.

Una revisión adicional del progreso histórico del monitoreo y control por computadora, con un énfasis particular en el monitoreo y control de procesos de fermentación en las últimas cuatro décadas, es proporcionada por la revisión de Junker y Wang en conmemoración del septuagésimo cumpleaños de Daniel I.C. Wang, cuya investigación ha dado forma significativa a las direcciones del control y monitoreo de bioprocesos por computadora.

El desarrollo temprano de medición analítica para el monitoreo de biorreactores se centró en la aplicación de principios de ingeniería, como el balance de masa y energía, junto con métodos de medición tradicionales existentes. Tales enfoques todavía se utilizan ampliamente en el monitoreo de bioprocesos y forman una parte sustancial de los sistemas de monitoreo avanzados que utilizan conceptos más avanzados de sensores virtuales.

En el contexto del modelado multivariante para el monitoreo de bioprocesos, es importante tener en cuenta que los métodos de medición tradicionales suelen proporcionar conjuntos de datos extensos con una frecuencia de muestreo relativamente alta, lo que a menudo requiere un preprocesamiento y reducción de datos. En aplicaciones industriales, las frecuencias de muestreo se establecen a menudo en registros de excepción, con valores de sensores registrados solo cuando se satisfacen criterios específicos para un cambio respecto a los valores del punto de ajuste.

A pesar de la naturaleza establecida de los métodos de medición tradicionales en el bioprocesamiento, los enfoques de reducción de escala y alta capacidad cada vez más utilizados en el desarrollo de bioprocesos presentan desafíos adicionales incluso en esta área. La medición analítica para el monitoreo de biorreactores en tiempo real de variables de proceso físicas y químicas relativamente sencillas en microbioreactores puede aumentar considerablemente los desafíos de monitoreo.

La mayoría de las plataformas disponibles comercialmente para el microprocesamiento y el procesamiento de alto rendimiento en bioprocesos proporcionan capacidades de monitoreo fundamentales (para una revisión útil de dicho procesamiento para procesos de cultivo de células animales, ver, por ejemplo, Kim et al.). Estas capacidades generalmente cubren la temperatura, el pH y, en algunos casos, los niveles de oxígeno disuelto, mientras que las variables biológicamente relevantes, como el número de células o actividades, se miden fuera de línea.

A escalas más pequeñas, las mediciones y el control del pH y el oxígeno disuelto (y/o el dióxido de carbono disuelto en el caso de cultivos celulares) a menudo se basan en las propiedades de extinción de colorantes fluorescentes. Esto introduce desafíos adicionales al monitoreo en términos de rango y sensibilidad.

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Modelado multivariante para monitoreo y control de biorreactores

Durante la última década, la importancia del monitoreo, modelado y control de biorreactores ganó rápidamente prominencia en la comunidad científica y la industria, en parte debido al énfasis puesto en este aspecto del procesamiento por parte de las tecnologías de calidad por diseño (QbD) y análisis de procesos. (PAT) documentos de directrices.

Otro impulsor importante que eleva la importancia de esta disciplina es el impacto del monitoreo y efectivo control de biorreactores sobre el desempeño comercial de la industria manufacturera.

Además, el modelado puede acelerar significativamente el desarrollo de bioprocesos, mejorando la competitividad en el mercado de nuevos productos y ramas emergentes de la industria de bioprocesos, incluidas las terapias celulares, las tecnologías de células madre y la producción de órganos artificiales descrita anteriormente en este blog.

Actualmente existe una plétora de artículos científicos, revisiones y libros que tratan sobre aspectos del control de biorreactores, modelado y monitoreo de bioprocesos. Una búsqueda rápida en Web of Science de estas palabras clave indica 3214 entradas en todos los años.

Sin embargo, este campo científico sigue creciendo y evolucionando para abarcar los últimos avances en métodos analíticos, así como en biorreactores de un solo uso, microbiorreactores y de reducción de escala, y tecnología de alto rendimiento, que se utilizan cada vez más en las industrias de bioprocesos.

Estos aspectos introducen oportunidades y desafíos adicionales para el monitoreo, modelado y control de procesos típicamente altamente complejos dentro de esta esfera estrictamente regulada.

Por ejemplo, los informes de las reuniones del panel de expertos de la sección de modelado, seguimiento, medición y control (M3C) de la Sociedad Europea de Ciencias de Ingeniería Bioquímica (ESBES) sobre modelado híbrido, procesamiento de cultivos celulares, microbiorreactores y sensores blandos en bioprocesos. industrias resumen el estado del arte en las respectivas áreas científicas y proponen recomendaciones para el desarrollo futuro en cada área con relevancia para el monitoreo y control en bioindustrias.

Un tema recurrente en estos informes es la necesidad de técnicas analíticas más precisas, que proporcionen mediciones confiables, oportunas y representativas de los parámetros críticos del proceso (CPP) incluso a concentraciones muy bajas de analitos y un mayor desarrollo y aplicación industrial exitosa de representaciones matemáticas de los bioprocesos.

Por lo tanto, brindaremos una descripción general de los métodos de medición que se aplican actualmente en la medición y el monitoreo de bioprocesos y luego revisa los métodos de análisis de datos multivariados utilizados para la exploración y el modelado de datos de bioprocesos con el fin de monitorear y controlar. El modelado de bioprocesos basado en la comprensión de los primeros principios de los procesos biológicos subyacentes está fuera del alcance de esta publicación, pero se remite a los lectores a varias revisiones y artículos específicos que tratan este tema para sus respectivos procesos.

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Procesos integrados en biorreactores.

En un ejemplo extremo pero impresionante de procesos integrados en biorreactores es el de Caparon y su equipo, ellos informaron sobre los desafíos de purificación que Pfizer enfrentó al purificar una variante de apolipoproteína producida en E. coli.

Parecía que varios HCP (proteínas de alto contenido en histidina) se estaban coeluyendo con el producto, y que se estaba generando una forma truncada del mismo.

Los procesos integrados en biorreactores de purificación que involucraron cinco pasos cromatográficos (tres de intercambio iónico y dos de hidrofobicidad) fue insuficiente para proporcionar una eliminación sólida de los HCP.

Se utilizaron múltiples métodos analíticos, incluyendo electroforesis en gel 1D y 2D, Western blot, deglicosilación de proteínas, espectrometría de masas (MS), degradación de Edman y un ELISA sandwich.

El análisis de Western blot bidimensional de las muestras purificadas de ApoA-1M detectó dos HCP principales junto con 6-7 especies menores de HCP. Estos dos HCP principales tienen pesos moleculares alrededor de 60 kDa, cada uno exhibiendo múltiples formas en el gel 2D de una muestra de proteína purificada en procesos integrados en biorreactores.

Tanto el peso molecular como el punto isoeléctrico de estos HCP son bastante cercanos a los del dímero del producto (56 kDa, pI: 5.1-5.3), lo que puede explicar por qué se copurificaron con el producto.

Esto permitió localizar estos HCP en el gel teñido correspondiente con una alta carga y luego aislarlos mediante electroforesis 2D para su identificación mediante espectrometría de masas.

Se identificaron tres HCP: una proteína de unión a dipéptidos y una proteína de unión a oligopéptidos con tamaños y cargas cercanas a las del dímero del producto, ambas presentes en abundancia en el periplasma de E. coli; una proteína periplásmica de unión a maltosa con un tamaño ligeramente más pequeño.

Además, se sospechó que una proteasa bacteriana fue la causa de la reacción de clivaje del producto en los procesos integrados en biorreactores. Se decidió llevar a cabo un proceso de segunda generación eliminando secuencialmente los genes de estos cuatro compuestos, utilizando un método descrito por Link et al.

Los resultados muestran que la eliminación 2 se refiere a la eliminación de las proteínas de unión a dipéptidos y oligopéptidos, la eliminación 3 se refiere a la eliminación adicional de la proteína de unión a maltosa, y la eliminación 4 se refiere a la eliminación adicional de la proteasa.

Se puede observar en la tabla que estas identificaciones fueron exitosas: el nivel de HCP se ha reducido drásticamente (los Western blots 2D correspondientes – datos no mostrados – no presentan ninguna traza de los HCP vistos anteriormente).

Además, el porcentaje de la forma de producto truncado está bien controlado, lo que indica que la proteasa fue la causa de la truncación.

El proceso de purificación en biorreactores para este proceso de próxima generación se simplificó drásticamente, con solo dos columnas de pulido necesarias para lograr la pureza deseada.

Este es un ejemplo inusual, tanto en el nivel de dificultad del proceso de purificación como en el grado de éxito que las eliminaciones genéticas pudieron proporcionar. Sin embargo, muestra el valor de hacer cambios fundamentales cuando el problema es lo suficientemente difícil en procesos integrados en biorreactores.

Otra tendencia importante en el procesamiento integrado es el uso de operaciones unitarias continuas. Si bien la ingeniería clásica sugiere que los procesos operados continuamente en estado estacionario son más eficientes que los procesos por lotes, la industria biotecnológica ha estado históricamente dominada por el procesamiento por lotes.

Aunque algunos productos fueron fabricados comercialmente mediante cultivo celular de perfusión, fueron excepciones; y hasta ahora no se ha fabricado ningún producto biológico comercial utilizando cromatografía continua.

Sin embargo, tanto el cultivo de perfusión como la cromatografía continua están siendo evaluados críticamente por muchas empresas en colaboración con muchos académicos, y el futuro cercano puede decidir si se avecina un cambio drástico en el procesamiento biológico.

Genzyme ha realizado una contribución sustancial para demostrar la robustez de dichos procesos continuos para biológicos complejos: sus publicaciones recientes han demostrado que la estabilidad del proceso y la calidad del producto se han mantenido durante muchas semanas en una sola ejecución de un proceso continuo.

Su documento reciente resumió sus hallazgos. Utilizaron biorreactores de perfusión y cromatografía periódica contracorriente de cuatro columnas (PCC) para producir y purificar varios terapéuticos ejemplares, incluyendo un mAb y una enzima humana recombinante.

Se logró un estado cuasiestacionario en el biorreactor en aproximadamente 50-60 millones de células ml−1 durante más de 60 días.

El sistema PCC completamente automatizado se ejecutó durante más de 30 días, con una calidad de producto comparable a la de un proceso de purificación por lotes tradicional.

Esta integración se logró con la eliminación de varios pasos de retención que serían necesarios en la operación de lotes tradicional.

La literatura se beneficiaría de otros informes de este tipo que describan procesos continuos operados durante largos períodos.

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Interacciones en biorreactores con pasos cromatográficos

La integración del biorreactor de procesos ha sido reconocida durante mucho tiempo como un camino prometedor para reducir costos y mejorar el rendimiento en la producción de productos biológicos.

Kumar et al. presentaron una integración del biorreactor y el paso de captura del producto para la producción de uroquinasa a partir de cultivos celulares animales.

En este estudio, se utilizó una columna continua de criogel de poliacrilamida supermacroporosa para proporcionar un andamiaje para el crecimiento y la proliferación de células dependientes del anclaje y, al mismo tiempo, como adsorbente para la captura del producto de uroquinasa.

Se utilizaron las líneas celulares de fibrosarcoma humano HT1080 y cáncer de colon humano HCT116. Una indicación del valor del doble papel desempeñado por la columna de criogel se ofrece mediante la comparación directa que los autores hicieron del sistema actual con integración de un biorreactor estándar seguido de una columna cromatográfica.

Se descubrió que este último se obstruía rápidamente con los restos celulares, mientras que el primero funcionaba de manera efectiva sin necesidad de un paso de recolección de células intermedio.

El uso de estrategias de recolección de productos inmediatas es bastante común en los cultivos de células vegetales; un ejemplo típico lo proporciona Gao et al., quienes informaron mejoras significativas en la recuperación del producto taxiyunnanina C de suspensión de cultivos de Taxus chinensis a través de la adsorción in situ.

Combinaron esta adsorción con una elicitación repetida con un análogo de jasmonato y una estrategia de alimentación de sacarosa optimizada en bioreactores con tanques de acero.

Los mejores resultados obtenidos, aproximadamente 1.7gl−1, representaron más del doble del valor más alto previamente reportado en la literatura. Se encontró que más del 90% del producto generado se adsorbió a las resinas XAD utilizadas, lo que también simplificó el posterior procesamiento.

La adsorción en lecho expandido (EBA) se ha utilizado en el pasado, más comúnmente con funcionalidad de intercambio iónico, para intentar alimentar directamente el caldo celular en una columna cromatográfica, eliminando así los pasos de clarificación. Kelly et al. recientemente investigaron adsorbentes de EBA de alta densidad de partículas de próxima generación, incluyendo dos resinas de modo mixto, para la captura directa de una proteína recombinante expresada en levadura a altas densidades celulares.

Utilizando la resina más retentiva, Fastline® MabDirect, se encontró una unión competitiva de proteínas no objetivo, y la adsorción de un caldo celular que contiene 5-10% de células redujo la capacidad de unión de equilibrio en un 30% a 50 mg ml−1 de lecho asentado.

El proceso fue aproximadamente comparable a bajas tasas de flujo con un proceso convencional que utiliza lechos empaquetados en términos de rendimiento de paso y niveles de HCP, pero eliminó sustancialmente menos ADN (alrededor de 50 veces menos que el proceso convencional).

A medida que las densidades celulares y la complejidad estructural de los productos proteicos aumentan, la clarificación puede volverse más costosa y llevar más tiempo; por lo tanto, la EBA puede resultar económicamente atractiva.

Genuinas interacciones de múltiples pasos: Hay escasez de datos experimentales en la literatura sobre la evaluación combinada de los pasos de cultivo celular y el pulido cromatográfico, sin duda debido a la complejidad de tales experimentos. Sin embargo, dichos datos ayudarían a evaluar si el óptimo global (por ejemplo, para la productividad general) para la secuencia es sustancialmente diferente de la combinación de los óptimos individuales para cada paso.

Recientemente se ha simulado esta situación para un producto con cinco especies sialiladas para la secuencia en la integración de un biorreactor de alimentación por lotes y dos columnas cromatográficas de pulido.

(Se asumió que los pasos intermedios de clarificación y captura no afectaban sustancialmente la distribución de glicofórmas.) Se supuso que el cultivo celular producía una distribución uniforme o simétrica de formas sialiladas, como primera aproximación.

El orden de elución del producto de las columnas de pulido de intercambio catiónico (CX) e interacción hidrofóbica (HIC) se invirtió: la especie más sialilada fue la más retenida en la columna CX, al ser la más cargada negativamente, y la menos retenida en la columna HIC por la misma razón.

(Se supone que estas cargas sialil juegan un papel crítico en la configuración de unión asumida por la proteína en ambos adsorbentes.) Simulaciones detalladas del proceso llevaron a la comparación de las secuencias HIC-CX y CX-HIC para las diferentes distribuciones sialiladas para cuatro parámetros operativos en cada paso cromatográfico: carga, velocidad de flujo, pendiente del gradiente y nivel inicial del modulador.

(De hecho, todo el material combinado de la primera columna se alimentó en la segunda columna, eliminando así el parámetro de carga como variable independiente para la segunda columna; esto resultó en siete variables independientes para la secuencia de pulido de las dos columnas). Las interacciones resultaron ser bastante complejas y condujeron a ventanas de operación complejas en los parámetros de operación.

Se consideraron varias funciones objetivo: rendimiento, pureza, cantidad de producto aceptablemente puro recuperado, capacidad de procesamiento y la relación molar de ácido siálico (relación de ácido siálico a relación de proteína), y se construyeron gráficos de Pareto para la optimización multicriterio.

Estos resultados se compararon con los resultados análogos para funciones objetivo escalarizadas, por ejemplo, combinando muchas o todas las funciones objetivo individuales en un solo producto ponderado (un enfoque que es bastante común como cálculo de caso base en la optimización multicriterio).

El resultado central fue, como era de esperar, que la calidad del producto era tan importante como su cantidad, y que existían condiciones en las que sería ventajoso reducir la tasa de formación del producto para mejorar su calidad.

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Interacciones con la centrifugación y con los pasos de filtración

La centrifugación es un paso de cosecha crítico en la industria biotecnológica, particularmente a escala de fabricación.

King et al. contribuyeron con una evaluación importante de la importancia de los parámetros operativos para el procesamiento de interacciones con la centrifugación típico, quienes llevaron a cabo un análisis de sensibilidad global (GSA) de la centrifugación de caldos de células de levadura de mamíferos y de alta densidad.

Demostraron que el análisis global mostró diferencias importantes, debido a las interacciones, que los cálculos de sensibilidad de un solo parámetro más tradicionales.

También demostraron que el tamaño crítico de las partículas era el parámetro más importante en el procesamiento del caldo de células de mamíferos y que la velocidad de flujo era el parámetro más importante en el procesamiento del caldo de células de levadura. Naturalmente, tales conclusiones se limitan a los rangos en los que se realizó el GSA.

Dichos resultados son importantes para evaluar el efecto combinado del biorreactor y la centrífuga: el caudal operativo de la centrífuga y su rendimiento (normalmente el nivel de clarificación) deben elegirse en función de la dependencia interactiva de los parámetros relevantes del caldo celular.

Li et al. presentó un ejemplo instructivo del impacto acumulativo de la fermentación y la homogeneización en las interacciones con la centrifugación en un formato ultra reducido.

Se sabe que las condiciones de fermentación afectan la homogeneización, por ejemplo, las células recolectadas en la fase exponencial son más fáciles de homogeneizar que las células recolectadas en la fase estacionaria.

La homogeneización, a su vez, afecta a las interacciones con la centrifugación, así como a los pasos posteriores, como la cromatografía. Por lo tanto, es extremadamente importante imitar cuantitativamente el proceso a escala de banco o de fabricación en el formato USD.

Li et al. pudieron demostrar que los parámetros críticos se conservaron cuantitativamente al usar acústica enfocada para reemplazar la homogeneización.

Una variedad de pasos de filtración de flujo tangencial y sin salida se encuentran comúnmente en las secuencias de bioprocesos en la actualidad; Reis y Zydney brindan un resumen útil.

Crucell (ahora una subsidiaria de Johnson & Johnson) presentó un enfoque interesante para la separación celular a densidades extremadamente altas (aproximadamente 120 millones de células PER.C6 por ml).

La filtración profunda en biorreactores no puede hacer frente a cargas tan altas; mientras que las interacciones con la centrifugación puede, es probable que se vuelva costosa y lenta y resulte en una recuperación reducida.

La floculación también puede ser efectiva, pero luego presenta un desafío de separación adicional debido a los floculantes agregados.

En este trabajo, Schirmer et al. utilizaron resinas de intercambio iónico (IEX) como paso de pretratamiento para inducir la sedimentación celular y, por lo tanto, reducir la carga en un paso posterior de filtración en profundidad.

Las tasas de sedimentación (que son proporcionales a los volúmenes de sobrenadante informados en función del tiempo) para una variedad de resinas; el mejor de estos, la politeilenimina a base de silicio o Si-PEI, también demostró proporcionar una reducción del 40 % en los niveles de proteína de la célula huésped (HCP) mediante adsorción electrostática.

Este es un enfoque inusual para resolver un problema de cultivo celular, de densidad celular extremadamente alta, que por supuesto corresponde a tasas de generación de producto muy altas, al incorporar un paso que tradicionalmente se usa para pulir mucho más aguas abajo en la fase de recuperación, para abordar la alta densidad celular mientras sigue proporcionando autorización HCP.

Estudios posteriores con cantidades variables de Si-PEI demostraron que al aumentar la cantidad de resina se reducía el nivel de células mientras se mantenía la recuperación del producto.

Felo et al. analizó un proceso de cosecha de dos pasos, siendo el primer paso la centrifugación o la filtración profunda, y el segundo paso la clarificación secundaria por filtración profunda.

El caso base fue la recolección de un biorreactor de 5000 l con una línea de células CHO para producir un mAb. La Tabla 12.3 describe el rango de valores considerado en su análisis de sensibilidad.

El resultado esencial proporcionado en la Figura 12.5 muestra que las interacciones con la centrifugación es ligeramente mejor en este estudio para volúmenes de biorreactor superiores a 5000 l. Sin embargo, esta ventaja de costo disminuyó del 6,2 % al 2,4 % a medida que el título celular aumentó de 0,5 a 10 g l−1.

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Biorreactores – Mejoras en el cultivo celular

La lista de posibles interacciones y Mejoras en el cultivo celular es grande y compleja. Se pueden ver que múltiples interacciones de muchos tipos han sido reportadas en la literatura. Se necesitan más datos cuantitativos de este tipo para evaluar qué tan global debería ser el proceso de diseño, especialmente para productos en etapas tempranas del proceso de desarrollo, por ejemplo, ensayos clínicos de Fase I o II.

Estas compensaciones en biorreactores y mejoras en el cultivo celular aclaran que un bioproceso debe diseñarse globalmente: es poco probable que optimizar cada paso individualmente conduzca a un conjunto óptimo global de condiciones operativas. Un paso muy pobre puede comprometer la eficiencia de todo el bioproceso; por lo tanto, es mejor aceptar alguna disminución en el desempeño en otros pasos para mejorar sustancialmente el desempeño de este pobre paso.

Hay excepciones en cuanto a mejoras en el cultivo celular, esta interactividad entre los pasos; por ejemplo, mostró que la ingeniería celular podría mejorarse sin impactos negativos aguas abajo. Pero se debe demostrar esta falta de interactividad, que aún requiere una visión integrada de los cambios propuestos.

Tradicionalmente, los medios de cultivo celular se complementaron con el uso de suero, o con el uso de proteínas séricas como la transferrina, para mejorar las tasas de crecimiento y brindar cierta protección contra el estrés de cizallamiento. Sin embargo, estos medios eran altamente variables y complicados en el procesamiento posterior. El uso de medios químicamente definidos ha disminuido la variabilidad en todo el bioproceso.

No obstante, algunos aditivos, como los agentes antiespumantes, aún pueden tener efectos nocivos en el procesamiento posterior, por ejemplo, en la filtración y la cromatografía.

La compensación entre el aumento de la tasa de crecimiento específico y la tasa y la calidad del producto es un tema de gran importancia actual.

Srivastava et al. encontraron experimentalmente que se podían mantener altas productividades específicas y altas tasas de glicosilación para varias líneas celulares a través de la optimización de las estrategias de alimentación, es decir, no encontraron que tenían que reducir significativamente las productividades específicas para mantener altos niveles de glicosilación.

Este es un resultado extremadamente interesante, ya que la sabiduría convencional es que tal pérdida es esperable.

Matemáticamente, uno esperaría finalmente alcanzar parte de una superficie de Pareto, sobre la cual la mejora de un componente de una función objetivo multicriterio conduce inevitablemente al empeoramiento de al menos otro componente.

(Es posible que estos resultados experimentales aún no hayan alcanzado una superficie de Pareto, en cuyo caso se podrían esperar Mejoras en el cultivo celular

 adicionales hasta que se alcance dicha superficie).

Es de esperar que se publiquen más resultados de este tipo, lo que permitirá que el campo alcance una comprensión más estable de esta compensación crítica.

Otra indicación de tal compensación fue publicada recientemente por Nocon et al. Construyeron un modelo a nivel de genoma para el metabolismo central de Pichia pastoris y lo utilizaron para evaluar el impacto de la sobreproducción de proteínas heterólogas en el metabolismo primario. Los resultados mostraron objetivos de sobreexpresión en la vía de las pentosas y el ciclo TCA, y objetivos de inactivación en varios puntos de ramificación en la vía de la glucólisis.

Hacer los cambios apropiados condujo a una mayor producción de la proteína heteróloga y a Mejoras en el cultivo celular, (superóxido dismutasa humana citosólica) en cinco de nueve objetivos. Sería fascinante evaluar el impacto adicional de la incorporación de variantes de proteínas, como glicoformas, para discutir el posible equilibrio entre la calidad y la cantidad del producto discutido anteriormente.

Un ejemplo interesante de ingeniería celular es la sobreexpresión de la vía de translocación de arginina gemela (Tat) en Escherichia coli.

La vía Tat, que puede exportar proteínas potencialmente valiosas que no pueden ser exportadas por la vía Sec, tiene una baja capacidad en la forma nativa.

La ingeniería de las células para sobreexpresar la vía Tat condujo a una mejora del 25 % en la tasa de crecimiento y un aumento de 40 veces en la acumulación periplásmica de la proteína deseada. Además, la integridad de la membrana no se vio afectada en las pruebas con niveles crecientes de cizallamiento.

Un modelo a escala reducida de centrifugación continua de pilas de discos predijo que la sobreexpresión de la vía Tat no afectaba a los pasos de recuperación.

Este es un caso en el que la optimización de un paso no tuvo consecuencias perjudiciales en los pasos posteriores.

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Características de los bioprocesos

Un rasgo o características de los bioprocesos es la falta de información detallada sobre el perfil de impurezas en el producto final.

Esta información incompleta ha sido una razón importante para el enfoque empírico del diseño de bioprocesos incorporado en el dicho “el proceso es el producto”.

Afortunadamente, la tendencia reciente hacia la comprensión fundamental de los eventos críticos en la fabricación, impulsada por la iniciativa de «calidad por diseño» de las agencias reguladoras, y el valor cada vez mayor que se le da a los modelos sólidos de características de los bioprocesos dentro de la industria, han llevado a análisis más detallados de bioprocesos individuales y operaciones unitarias.

Sin embargo, aún existe la necesidad urgente de combinar operaciones unitarias y buscar modelos integrados y comprensión de las características de los bioprocesos. En ese contexto, este capítulo describe las interacciones entre el paso del biorreactor y los que le siguen.

Ahora se reconoce ampliamente en las características de los bioprocesos que los muchos parámetros elegidos para aumentar la eficiencia del paso de cultivo celular pueden tener consecuencias importantes para las operaciones unitarias posteriores.

Por ejemplo, se ha descubierto que el uso de sulfato de dextrano para reducir la acumulación de células promueve cambios en la estructura de las proteínas del producto, lo que a menudo acelera su agregación y reduce su vida útil.

Otro ejemplo de las características de los bioprocesos es la extensión de la duración de un biorreactor de producción para aumentar la productividad: en algunos casos, dichas operaciones prolongadas del reactor, con viabilidades celulares finales inferiores al 80 %, parecen conducir a cambios en el plegamiento de las proteínas del producto.

Sin embargo, tales interacciones en todo el bioproceso no han recibido una atención cuantitativa significativa en la literatura, a pesar de su importancia.

Este capítulo resume las interacciones entre el cultivo celular y los pasos posteriores de aislamiento, recuperación y purificación.

La clase A, que describe las métricas relevantes dentro del biorreactor, incluye las métricas habituales para la productividad del biorreactor: la tasa de crecimiento representa la eficacia con la que se producen las células y la productividad específica de la célula representa la eficacia de una única célula (promedio) en la generación producto.

Sin embargo, existen otros parámetros que son importantes para las características de bioprocesos la calidad del producto elaborado en el biorreactor, que también se enumeran en la Clase A.

Si el producto se puede encontrar en varias formas multiméricas, la fracción de la(s) forma(s) deseada(s) es una métrica importante de calidad; a menudo, el monómero es la variante deseada, y varias formas agregadas (dímero, trímero, etc.) son indeseables.

De manera similar, si el producto está apreciablemente glicosilado, el grado de glicosilación podría ser crítico. Una medida aproximada de glicosilación que se usa a menudo en la industria es la relación molar de ácido siálico al producto.

Como se analizan las características de los bioprocesos, tal relación molar puede ser engañosa; es más a menudo importante caracterizar el grado de glicosilación; en particular, la forma aglicosilada puede eliminarse tan rápidamente cuando el producto se introduce en el torrente sanguíneo de un paciente que no debe considerarse como una variante útil del producto. Las interacciones entre los parámetros dentro de la Clase A representan una forma de compensación en la optimización de la operación del biorreactor.

De la misma manera, todas las métricas de calidad del producto para todos los pasos aguas abajo del biorreactor se enumeran en la Clase B.

Esto no solo podría incluir parámetros de calidad del producto del tipo ya discutido, sino también medidas generales de eficiencia, como el rendimiento o el rendimiento, que pueden verse afectados por las condiciones del biorreactor.

Por ejemplo, si el biorreactor se ejecuta hasta una viabilidad final baja para maximizar la formación del producto, el impacto posterior de las células lisadas en los pasos de recuperación, como la centrifugación o la filtración, podría ser sustancial.

Si el costo de aumentar la cantidad de producto en el biorreactor es que el paso de filtración o centrifugación toma el doble de tiempo, y posiblemente con una reducción sustancial en el rendimiento del paso, esto puede no representar el bioproceso globalmente óptimo.

Una interacción entre cualquier métrica de la Clase B y cualquier métrica de la Clase A representa otra forma de compensación en la optimización de la operación del biorreactor. (Existe una tercera forma de compensación, que involucra dos o más métricas en la Clase B, pero está fuera del alcance de este capítulo).

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