Reducción del biorreactor al formato microfluídico

El motivo general para reducir los biorreactores es usarlos para la optimización del proceso. Debido a su pequeño tamaño, reducen el costo, aumentan el rendimiento y reducen la mano de obra involucrada. Además, los tiempos de reacción y proceso son más cortos debido a tiempos de difusión más cortos de factores solubles. Otro factor determinante es que con dispositivos más pequeños es más fácil optimizar procesos en paralelo y que los dispositivos microfluídicos se presten para ser automatizados. Sin embargo, no están al mismo nivel de automatización que los sistemas robóticos de manejo de líquidos. Hay ejemplos reales donde los microrreactores funcionan mejor que los sistemas convencionales. Un ejemplo es la eficiencia de la digestión de la enzima inmovilizada en las paredes de un microtubo, que tuvo un mayor rendimiento en comparación con los sistemas de digestión en solución. Esto se debe a que los microfluídicos tienen una relación superficie / volumen mucho mayor que los recipientes del reactor.

Muchos de los reactores descritos en este capítulo se han comparado con reactores a escala de banco que muestran resultados similares. La cuestión de si el microbioreactor puede ampliarse a biorreactores de tamaño industrial permanece.

Métodos de microfabricación para biorreactores en un chip

Hay varias formas de fabricar un microsistema.  Uno de estos procesos es la litografía suave, una técnica que es uno de los métodos más utilizados para la fabricación de microfluidos. Además, la técnica de fabricación mecánica fina es una opción, ya que los agujeros pueden perforarse hasta 100 μm de diámetro. En estos días, el mecanizado con láser es más accesible, pero para alcanzar una alta precisión se necesita un láser de alta precisión, lo que elevará el precio.

Para realizar la microfabricación, en la mayoría de los casos, se necesita una sala limpia para evitar que el polvo se deposite en el dispositivo. Dependiendo del método de fabricación utilizado, se necesita una clase diferente de sala limpia. Clase, en este caso, significa el número de partículas de polvo por metro cúbico. Para hacerse una idea, para la litografía suave se necesita una limpieza de 1000–10000partículas − 3 (ISO clase 4-5). En el otro lado de la escala está la fabricación de microelectrónica, de 1 a 10 partículas m − 3(ISO clase 1 – 2), al definir un tamaño de partícula de 0.3 μm.

Grabado de silicio / vidrio

Aunque el vidrio podría ser el material más deseado para usar en aplicaciones de biotecnología debido a sus propiedades ópticas y compatibilidad biológica, es un material difícil de procesar debido a su fragilidadExisten algunos métodos para procesar el vidrio: granallado en polvo, grabado profundo con iones reactivos (DRIE), grabado húmedo y mecanizado con láserDe todos estos métodos, el grabado húmedo con HF da buenos resultados, a pesar de que es un proceso isotrópico, pero es el más peligroso de los métodos, que no se recomienda para un laboratorio estándar, ya que son necesarias normas especiales de capacitación y seguridad. Además, no todos los laboratorios permiten HF en sus instalaciones. DRIE es un método de grabado muy lento, y el equipo es muy costoso, lo que no siempre está disponible en salas limpias. Sin embargo, el proceso puede ser extremadamente preciso para características pequeñas (0.5 μm). La voladura de polvo también dará resultados significativos, excepto que las paredes se ahusan en un ángulo de aproximadamente 12-15∘, pero el tamaño mínimo de la característica es de alrededor de 50 μm.  

Litografía suave

Desde la introducción de la litografía suave ha provocado el despegue de la microfluídica.  Es un método de moldeo de réplica relativamente barato con una alta rotación posible. Sin embargo, la obtención de un molde requeriría el uso de una sala limpia equipada con litografía, que es básicamente un alineador de máscara (u otra fuente de luz UV; [42]), un recubrimiento por rotación, placas calientes y un banco de solventes. La fotorresistencia más utilizada es SU8, que está disponible en diferentes viscosidades, lo que da como resultado diferentes alturas de características. Dependiendo del tamaño de la función, hay diferentes opciones de máscara. Para todo lo que supere los 20 μm, se pueden imprimir máscaras de aluminio. Para características entre 5 y 20 μm, se necesitan máscaras de soda-lima (∼ $ 500–1000, dependiendo de la cantidad de características en el). Para características entre 0.5 y 5 μm, se necesitan máscaras de cuarzo (> $ 1500). Para tamaños de características más pequeños, el proceso se vuelve un poco más complicado al usar un paso a paso, que básicamente reduce los tamaños de características en la máscara al transferir ópticamente el patrón a través de una lente.

Estampado en caliente

Para ampliar la producción, se podría considerar la impresión. Este método utiliza plásticos, como PMMA (o acrílico) para hacer chips en grandes cantidades mediante el uso de un molde de silicio o metal para presionar bajo presión en plástico calentado. Los tamaños de características en el rango submicrónico se pueden replicar. Este método solo es recomendable para la producción a gran escala, no para procesos de desarrollo rápido.

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Biorreactores – Ventajas de los microsistemas

Los sistemas biológicos están en la escala de micrómetros si observamos las propiedades de transporte fluídico y difusivo. Como tal, los biorreactores microfabricados tienen mucho sentido, ya que pueden imitar estas propiedades in vitro. Los dispositivos en el rango micro necesitan menos espacio, menos reactivos y menos energía, mientras que los tiempos de respuesta y, por lo tanto, las tasas de reacción aumentan. Hay una ganancia en la información sobre el espacio, en comparación con los equipos estándar, lo que también reduciría los costos. Una ventaja importante de los sistemas microfluídicos es la posibilidad de un alto rendimiento, que se requiere para tener una gran cantidad de ejecuciones del sistema para obtener datos estadísticamente significativos. Esto se aplica especialmente a los microbioreactores de perfusión microbiana en los que ha habido un progreso significativo en la implementación de alto rendimiento.

Otra ventaja de los microsistemas es la posibilidad de construir microambientes específicos de células debido al control preciso de las estructuras de microescala. La capacidad de controlar, por ejemplo, el patrón de flujo, proporciona control sobre el transporte de factores de crecimiento, reactivos, oxígeno y la cantidad de estrés hidrodinámico en las células. El tamaño de la cámara del biorreactor afectará el comportamiento de las células, alterando los fenómenos de transporte, debido a las distancias de difusión y las interacciones célula-célula. La velocidad de flujo puede tener un efecto en la dinámica de crecimiento celular. Por ejemplo, en un experimento, los fibroblastos se cultivaron bajo diversas condiciones de flujo en un microbioreactor: desde condiciones estáticas (sin flujo) hasta altas tasas de flujo. Las células mostraron poco crecimiento en condiciones sin flujo o en flujo alto (0.3mlh − 1), pero mostraron un crecimiento óptimo a 0.2mlh − 1. Las células madre embrionarias mostraron el mismo comportamiento hacia las tasas de flujo. No solo se ve afectado el crecimiento celular, sino también la viabilidad. Esto muestra que el microambiente impacta las funciones celulares y, por lo tanto, la respuesta de toxicidad hacia las drogas. El cultivo de células en un entorno microfluídico en un sistema perfundido continuo ofrece la capacidad de controlar la interacción de los medios celulares al producir un gradiente químico en estado estable, en comparación con el sistema de cultivo estándar donde la composición química cambia con el tiempo. En condiciones estáticas, la difusión es el método de transporte masivo dominante.

Las células pueden estar en contacto directo con un flujo o estar protegidas por una barrera microfabricada, sustrato de micro-ranura, oxigenadores de membrana internos o hidrogeles. Cuando está protegido, el efecto del esfuerzo cortante todavía está presente, pero en menor magnitud que cuando las células están en contacto directo con el flujo. Los cultivos celulares deben perfundirse para refrescar el medio de cultivo, pero las células también deben incubarse en factores solubles secretados, como las células alimentadoras para cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC). Un flujo eliminaría estos factores. Un método que facilita el cultivo a largo plazo (> 7 días) en flujo directo es usar un sistema de perfusión de “parada de flujo”: una exposición temporal corta seguida de largos períodos de incubación estática. Pulsos cortos de cizallas permitirían que las células sensibles al cizallamiento (como las hESC) soporten flujos de renovación medios, mientras que los largos períodos de incubación estática permitirían la acumulación local de factores secretados (es decir, factores de crecimiento). El método de «detención del flujo» podría ser adecuado para cultivar diferentes cultivos celulares con diferentes reacciones al esfuerzo cortante en el mismo microbiorreactor, cuando se expone directamente al flujo. Como tal, el protocolo de «parada baja» debe diseñarse de acuerdo con los requisitos de cultivo celular. En estas condiciones, las células se asemejan a las características convencionales del plato de cultivo.

Como tal, el protocolo de «parada baja» debe diseñarse de acuerdo con los requisitos de cultivo celular. En estas condiciones, las células se asemejan a las características convencionales del plato de cultivo. Los microbioreactores reducirían en gran medida la carga útil. También muestra que los sistemas de cultivo de células microfluídicas pueden ser autónomos.

Una ventaja importante de los sistemas microfluídicos es la capacidad de crear gradientes de concentración de productos químicos dentro del microbioreactor utilizando flujos laminares. Básicamente, un generador de gradiente es una serie de canales con diferentes contenidos fluídicos conectados a una cámara donde se forma el gradiente. Debido al carácter laminar de los flujos dentro de los microcanales, la mezcla solo ocurre por difusión. Una forma simple de formar un gradiente de concentración es tener dos soluciones fluyendo en un microcanal. Esto crea un flujo paralelo, que se mezclará lentamente por el canal. También se han desarrollado otros tipos de gradientes de concentración más complejos, incluidas las distribuciones lineales, sigmoidales y logarítmicas. La formación de gradientes de concentración en sistemas de pozos múltiples no es sencilla ya que las dosis deben crearse en diferentes pozos. Otra aplicación del generador de gradiente es la creación de dosis combinatorias de medicamentos, para lograr efectos más sinérgicos y establecer la relación óptima entre los medicamentos. Un ejemplo es probar el efecto de varias concentraciones de anestésicos, bupivacaína y lidocaína en los mioblastos. Tal control sobre las entregas de reactivos a concentraciones definidas muestra el potencial de BRoC que no se puede lograr fácilmente con plataformas de micropocillos convencionales.

También se puede lograr un gradiente de oxígeno a través de un microbiorreactor controlando la velocidad de flujo, para exponer las células al ambiente heterogéneo de oxígeno. A medida que el oxígeno se consume al comienzo del microrreactor donde entra el medio, quedará menos oxígeno en el otro extremo del microrreactor en la salida. El gradiente de oxígeno en el microrreactor imita las condiciones fisiológicas en los tejidos, por ejemplo, el hígado, donde las funciones localizadas en el hígado controlan la concentración local de oxígeno.

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Biorreactores en un chip

Comprender el comportamiento de las células y sus funciones durante el crecimiento y la producción, y la relación con el suministro de nutrientes es esencial en el campo de la biotecnología. La mayoría de los sistemas convencionales de cultivo celular funcionan en modo discontinuo, en el que se proporciona una cantidad fija de nutrientes y oxígeno para el cultivo celular inicial, lo que apoya el crecimiento hasta que faltan nutrientes y oxígeno.

Esto significa que debido al cambio constante en el ambiente, los cultivos discontinuos no son ideales para caracterizar y brindar una mejor comprensión de los procesos celulares. En cambio, es necesario un entorno más constante y controlado con precisión. El principio del quimiostato lo proporciona por su suministro continuo de nutrientes y oxígeno. A diferencia de los cultivos discontinuos, los cultivos de quimiostato continuo pueden funcionar durante semanas en estado estacionario. Sin embargo, el consumo y el costo de los medios de crecimiento, hasta 500 litros por cultivo de quimiostato para un reactor a escala de banco, no es realista, y mantener el sistema estéril durante la adición de medio o el muestreo es otro problema.

La microfluídica puede ofrecer una forma de abordar estas dificultades. Un sistema de biorreactor basado en microfluidos consumirá del orden de 10 ml a 1 l, en lugar de 500 l. La posibilidad de integración de sensores ópticos o electrónicos para medir y controlar diversas condiciones ambientales, así como la integración del manejo de fluidos, como bombas y válvulas y la posibilidad de paralelismo masivo, pueden dar a los biorreactores basados en microfluidos una ventaja que los biorreactores convencionales hacen no tienen.

Los microbioreactores tienen una cámara de reactor con volúmenes de alrededor de 50 a 800 μl, mientras que los biorreactores a escala de banco tienen un volumen típico de 0.5 a 5l . Algunas ventajas de los microbioreactores son la cantidad reducida de sustrato y las utilidades necesarias por experimento y los requisitos de espacio reducido para la operación en paralelo. Como estos dispositivos son desechables, también reducen los esfuerzos para prepararse para el experimento, ya que no tienen que limpiarse y esterilizarse después de su uso. Además, la automatización se hace más fácil.

Se obtiene una variedad de bioproductos a través del proceso de fermentación microbiana. Los productos pueden incluir metabolitos primarios, metabolitos secundarios, enzimas, proteínas terapéuticas y vacunas. El desarrollo de estos productos comienza con una fase de selección en la que muchas cepas bacterianas potenciales se seleccionan para obtener el mayor rendimiento del producto en ciertas condiciones de crecimiento. Cuando se identifica un candidato microbiano, la cepa se transfiere a la fase de desarrollo donde se estudia la fisiología de la cepa con más detalle, al igual que las condiciones de crecimiento en biorreactores a escala de banco con volúmenes de 0.5 – 10 l. La etapa final es una ampliación del volumen del biorreactor hasta alcanzar la escala de producción.

El cuello de botella de tiempo y trabajo en este trabajo de desarrollo es la fase de selección. Típicamente, los experimentos se llevan a cabo utilizando una combinación de placas de pocillos múltiples, placas de Petri y matraces de agitación. Estos medios convencionales permiten solo un control limitado del microambiente, y solo se pueden obtener datos de punto final del rendimiento de las células.

Una cuestión clave es que las células en los biorreactores deben agitarse para obtener un ambiente de cultivo más homogéneo, reduciendo los gradientes espaciales de los factores solubles. Esto es válido para los biorreactores de suspensión a gran escala, así como para los microbioreactores en el rango de microlitros. En este último caso, la agitación se puede lograr utilizando barras agitadoras magnéticas o termoconvección impulsada por flotabilidad. Las barras agitadoras magnéticas pueden ser útiles cuando se usan biorreactores individuales, pero cuando se usan muchos microbioreactores en paralelo, este método será más difícil de controlar. El método de termoconvección se ha aplicado a un formato de placa de 96 pocillos. La convección se logra colocando un calentador microfabricado debajo de cada pozo y creando una diferencia de temperatura de hasta 4 4°C. Se afirma que solo el 5% de la evaporación del medio se detectó después de 7 días. Sin embargo, cuando un cultivo se perfunde con medios en un sistema de cultivo de células microfluídicas, no hay necesidad de un agitador. Las distancias de difusión dentro de un microbioreactor verdadero son muy cortas, hasta 100 μm. Como tal, habrá una condición de cultivo celular como se encuentra en los tejidos in vivo. La pregunta es, por supuesto, ¿cuál es el objetivo del cultivo celular: imitar la fisiología in vivo u optimizar un cultivo celular para obtener el mayor rendimiento de los productos, sin tener en cuenta las similitudes in vivo? La respuesta es la siguiente: si las drogas se prueban para consumo humano, la primera situación es esencial; Si las drogas se producen por medio de cultivos de células microbianas, es preferible la última situación.

Existe la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías de cultivo de células microbianas de manera de alto rendimiento para mejorar nuestra comprensión de las funciones de los microorganismos en diferentes condiciones ambientales. Los biorreactores industriales y de escala de banco tienen la capacidad de controlar y medir la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto (OD), el CO2 y las densidades celulares (OD). Sin embargo, estos biorreactores son caros y también requieren mucho tiempo para funcionar en lotes paralelos. El creciente número de permutaciones genéticas y de procesos y optimizaciones necesarias para detectar nuevos productos necesitará formas más rápidas de recopilar todos esos datos. Los volúmenes de reactores más pequeños combinados con sensores integrados con un flujo de datos en tiempo real facilitarían la detección rentable y de alto rendimiento. Aunque la escala de banco ofrece algunos parámetros en tiempo real, como el OD y el pH, la biomasa todavía se mide fuera de línea, lo que aumenta la contaminación y reduce el volumen durante los experimentos. Esto conduce a condiciones de proceso alteradas. Los tubos y los matraces de agitación, que representan más del 90% de todos los experimentos de cultivo celular en biotecnología, se pueden operar en paralelo con volúmenes más pequeños, pero los datos solo se recopilan en el punto final. Reducir aún más los microbioreactores podría conducir a sistemas tales como matrices de microfermentadores o kits de análisis microbiológicos.

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Medición DOT y pH en biorreactores

El DOT y el pH de un caldo de cultivo representan dos de los parámetros de proceso más importantes en los cultivos biológicos. Los parámetros son indispensables para una caracterización fundamental de los bioprocesos. Para los matraces de agitación, se han informado puntos del sensor DOT autoclavables para mediciones de fluorescencia óptica. Estos sensores contienen un tinte de luminiscencia sensible al oxígeno. La concentración de oxígeno se determina mediante mediciones de por vida del luminóforo. Un desafío de la medición de DOT en el matraz de agitación es que las manchas tienen que estar cubiertas continuamente por medio de cultivo para evitar errores de medición. En particular, a altas frecuencias de agitación y bajos volúmenes de llenado, no hay una ubicación en el matraz que esté continuamente cubierta por el líquido a granel giratorio. Existen puntos de sensores similares para mediciones DOT en placas de microtitulación. La señal de fluorescencia se detecta de forma no invasiva mediante un cable de fibra óptica. En las placas de microtitulación, el líquido comúnmente cubre el fondo total durante la agitación. Potzkei desarrolló otro sensor para la medición de oxígeno en células vivas.  Este sensor se basa en la transferencia de energía de resonancia de Förster codificada genéticamente (FRET). Consiste en una fluorescente amarilla y una proteína fluorescente basada en el mononucleótido flavina (YFP-FbFP). Si hay oxígeno presente, se forma y madura YFP. En consecuencia, la intensidad de fluorescencia de FbFP medida disminuye debido a una transferencia de energía no radiactiva entre los cromóforos de FbFP y YFP. El sensor se aplicó con éxito para el monitoreo continuo en tiempo real de los cambios temporales de los niveles de O2 en el citoplasma de las células de E. coli durante un cultivo por lotes.

Para las mediciones de pH, hay disponibles sensores similares para matraces de agitación y placas de microtitulación. Las manchas se basan en la medición de fluorescencia y contienen un tinte fluorescente sensible al pH. El rango de medición del pH óptico está limitado a un rango de pH = 4.5 – 8.5. En la literatura se describe un dispositivo comercial para mediciones en línea de DOT y pH en matraces de agitación. Badugu y col. desarrolló una película de sensor de pH óptico radiométrico para bioprocesos, que puede miniaturizarse fácilmente. Es aplicable en placas de micropocillos y microbioreactores. El sensor se basa en un derivado de alilhidroxiquinolinio copolimerizado con polietilenglicol. Tiene dos máximos de excitación a 𝜆ex, 1 = 375 nm y 𝜆ex, 2 = 425 nm con un pico de emisión único a 𝜆em = 520 nm y puede usarse para determinar los valores de pH en el rango de pH = 5-8. La respuesta de pH de este sensor no es sensible a la fuerza iónica y la temperatura del medio.

Un método técnicamente simple para determinar el pH en soluciones acuosas en biorreactores es el uso del colorante fluorescente HPTS (sal trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico). HPTS es soluble en agua y se puede agregar a una solución acuosa. Dependiendo del pH prevaleciente, cambia la intensidad de fluorescencia de HPTS. Una aplicación exitosa de este colorante para determinar el pH en pozos de microtitulación se informa en la literatura. Los autores realizaron una medición ratiométrica. A dos longitudes de onda de excitación de 𝜆ex, 1 = 405 nm y 𝜆ex, 2 = 450 nm, la intensidad de emisión de fluorescencia se mide a 𝜆em = 520 nm, y se calcula la relación de ambas intensidades de emisión. Esta medición radiométrica reduce en gran medida los errores de medición debido al hecho de que las posibles alteraciones de la fuente de luz, los detectores ópticos y los ligeros cambios en la transmisión de luz a través de las fibras ópticas se compensan casi por completo. Además de la medición radiométrica, la referencia dual de por vida (DLF) es un método altamente preciso para realizar mediciones de fluorescencia. En ese caso, se mide el ángulo de fase de dos señales de fluorescencia estimuladas periódicamente.

Mientras que un tinte es un tinte de referencia insensible al pH, el segundo es sensible al pH. Si el pH cambia, el ángulo de fase del tinte sensible al pH también cambia, mientras que el ángulo de fase del tinte de referencia permanece constante. Finalmente, el pH puede determinarse a partir del cambio del ángulo de fase general medido. Este método es muy preciso y se minimizan los posibles errores, como las desviaciones de la señal del dispositivo de medición o la variación de la concentración de colorante, por ejemplo, el blanqueo. Kunze y col. Señaló que la medición de pH y DOT puede volverse incorrecta si las señales fluorescentes de los sensores ópticos están influenciadas por proteínas fluorescentes en el cultivo. Si los espectros de excitación de las proteínas fluorescentes en el caldo de cultivo, y los optodos de pH y DOT son similares y, además, la longitud de onda de emisión de fluorescencia de las proteínas es similar a la longitud de onda de emisión de los optodos, DOT y la señal de pH puede ser incorrecto.

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Monitoreo y Control de Microbioreactores

bioreactor-controles

El monitoreo de los parámetros biológicos es esencial para un análisis de proceso sistemático y resultados de detección razonables. Los parámetros relevantes, como la temperatura, el pH, el DOT, el OTR y las señales para la formación de biomasa y productos, son necesarios para la optimización y la ampliación del proceso. Para caracterizar integralmente un bioproceso, se deben aplicar diferentes condiciones de operación y mediciones. Los parámetros de operación deben aplicarse en diferentes combinaciones para cubrir una amplia gama de condiciones de cultivo. Esta variación de los parámetros operativos implica experimentos laboriosos y que requieren mucho tiempo. Para reducir el esfuerzo experimental y ahorrar tiempo, se puede utilizar DoE. La cantidad de datos de proceso obtenidos aumenta y, simultáneamente, el esfuerzo experimental se minimiza si se aplica DoE. 

Actualmente, se encuentran disponibles diferentes sensores fisicoquímicos y diversas técnicas de medición para sistemas de microbiorreactores. Los sensores fisicoquímicos generalmente se pueden aplicar en biorreactores a escala de banco sin mayores restricciones, mientras que la aplicación en biorreactores a pequeña escala es más difícil debido a los pequeños volúmenes de los vasos y al poco espacio dentro del biorreactor. Debido a estos desafíos, las técnicas de medición óptica a menudo se aplican en microbioreactores. La viabilidad de mediciones no invasivas, diseño miniaturizado y tiempos de respuesta rápidos hace que estas técnicas sean aptas para aplicaciones en biorreactores a pequeña escala. Además, la medición óptica integrada permite un diseño continuo del proceso sin interrumpir el cultivo microbiano durante las mediciones en microbioreactores agitados. Por ejemplo, se pueden realizar mediciones de luz dispersa y fluorescencia sin interrumpir el proceso de agitación durante un cultivo microbiano en microbiorreactores. Por ejemplo, se pueden realizar mediciones de luz dispersa y fluorescencia sin interrumpir el proceso de agitación durante un cultivo microbiano en microbiorreactores. Por lo tanto, se proporcionan condiciones de cultivo óptimas durante todo el tiempo de cultivo. Otro inconveniente de la técnica de medición invasiva, por ejemplo, la medición del pH con electrodos electroquímicos, es la alteración de la hidrodinámica del líquido dentro de los biorreactores. Como consecuencia, el cultivo cultivado puede verse afectado negativamente. En particular, a pequeños volúmenes de líquido, la influencia de los sensores en el líquido hidrodinámico podría volverse crítica. Por lo tanto, se prefieren las mediciones de luz dispersa y fluorescencia para determinar la biomasa y la formación de productos en placas de microtitulación. Se requieren proteínas fluorescentes específicas para controlar ópticamente la formación del producto. Las proteínas fluorescentes están unidas como etiquetas de fusión a las moléculas objetivo deseadas en microorganismos modificados genéticamente. Las etiquetas de fusión convencionales son la proteína fluorescente verde (GFP) y sus derivados, es decir, la proteína fluorescente amarilla (YFP), las proteínas fluorescentes a base de mononucleótidos de flavina (FbFP) y las etiquetas de triptófano. Las mediciones de fluorescencia también se utilizan para determinar el pH, el O2, el CO2 y el NH4.  Samorski desarrolló un dispositivo de cultivo para placas de microtitulación basado en luz óptica dispersa y mediciones de fluorescencia.  En este dispositivo, la placa de microtitulación se coloca sobre una mesa de agitación en una cámara de cultivo templada. Un cable de fibra óptica se mueve a través de una unidad x – y debajo de la placa de microtitulación y realiza mediciones ópticas automáticas de pocillos individuales de la placa de microtitulación. Este BioLector, llamado tecnología de medición, fue ampliamente validado y está disponible comercialmente en la empresa m2p-labs GmbH, Baesweiler, Alemania. Un prototipo de este dispositivo se utiliza en la Cátedra de Ingeniería Bioquímica de la Universidad RWTH Aachen. Con ese dispositivo, es posible el cultivo paralelo de hasta cuatro placas de microtitulación. Si se utilizan placas de 96 pocillos, en total 384 cultivos monitoreados en línea a través de luz dispersa y las mediciones de fluorescencia pueden realizarse en paralelo. 

Las mediciones de fluorescencia se pueden utilizar para determinar los perfiles de temperatura cualitativos en microbioreactores. Sin embargo, la medición precisa de la temperatura absoluta es más difícil. En microbioreactores agitados o chips microfluídicos, la temperatura se mide típicamente con termistores, detectores de temperatura de resistencia o termopares. Sin embargo, en los sistemas sacudidos, la medición y el control de la temperatura se integran comúnmente en la cámara de incubación en la que se coloca el microbiorreactor. Un control individual de los pocillos individuales en la placa de microtitulación agitada es complejo y costoso. Hasta ahora, solo se conoce un control de temperatura bien específico para un sistema comercial para placas de microtitulación agitadas (micro-matriz (anterior: 𝜇24).

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Alimentación controlada por enzimas del microbiorreactor

Un método enzimático es un método técnico simple, económico y fácil de aplicar para alimentar glucosa en microbiorreactores. En este enfoque, se añaden al medio de cultivo almidón y enzimas hidrolíticas, como la amilasa y la maltasa. La amilasa descompone el almidón en glucosa y maltosa. La maltosa se convierte en glucosa por la maltasa. A concentraciones de almidón suficientemente altas, la tasa de liberación de glucosa depende de la cantidad de enzimas activas en el caldo de cultivo. Se puede ajustar fácilmente cambiando la concentración de la enzima. Este método de liberación de sustrato enzimático se aplicó en un sistema de entrega automática de sustrato disponible comercialmente. En este sistema, se utiliza un gel de dos fases. La primera capa de agar contiene almidón. Sobre la primera capa, se coloca una segunda capa de agar sin almidón para mejorar el control de liberación si el almidón se difunde fuera del agar. El gel de agar de dos fases se puede fijar en el fondo de los matraces de agitación o las placas de microtitulación. En presencia de glucoamilasas, el almidón se degrada a glucosa, que es metabolizada por los microorganismos. Un inconveniente del sistema de liberación de sustrato enzimático es que está limitado a la glucosa como sustrato. Este sistema no se puede utilizar para microorganismos productores de amilasa, ya que, en presencia de otras amilasas, la liberación de glucosa se volverá indefinida. Además, si hay proteasas presentes durante el cultivo, la glucosidasa puede degradarse y, posteriormente, se inhibe la liberación del sustrato. Debe observarse que los valores óptimos de temperatura y pH pueden limitar significativamente la aplicabilidad de un sistema de liberación de sustrato enzimático.  Se desarrolló una versión mejorada de este sistema de liberación enzimática de glucosa. En lugar de usar una fase de gel, se usa un polímero que es completamente soluble en soluciones acuosas. Los cultivos de P. pastoris con un promotor AOX1 inducible por metanol se realizaron con éxito utilizando este sistema de liberación mejorada. Al aplicar la alimentación enzimática de glucosa, se han evitado las fases de inanición de carbono entre los pulsos de metanol comúnmente aplicados. Como resultado, se alcanzaron mayores densidades celulares y una actividad del producto tres veces mayor (lipasa fúngica). También se usó un sistema de liberación de glucosa controlado enzimáticamente para el cultivo de P. pastoris alimentado por lotes. En esta aplicación, se usó un medio de cultivo basado en un medio Syn6, que contiene un polímero de glucosa soluble. Después de la adición de glucosidasa al medio de cultivo, se inicia la liberación de glucosa.

Alimentación de microbiorreactores continuos por bombas nitiadas.

Un cultivo continuo de microorganismos tiene algunas ventajas en comparación con el modo de operación de biorreactores por lotes o por lotes. Los biorreactores operados de manera continua) proporcionan condiciones de cultivo constantes (estado estable) durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, son adecuados para investigar y cuantificar las propiedades específicas de las cepas microbianas debido al hecho de que algunos microorganismos reaccionan de manera sensible a los cambios del medio ambiente. Para los bioprocesos continuos convencionales, se utilizan principalmente biorreactores de tanque agitado. Para garantizar una condición de cultivo similar en la producción y el cribado, la aplicación de microbiorreactores con agitación es altamente adecuada. Sin embargo, los microbiorreactores con agitación tienen costos de inversión relativamente altos y son apenas adecuados para aplicaciones de alto rendimiento. El tiempo para alcanzar el equilibrio y las condiciones de operación en estado estable es demasiado largo para la detección eficiente de microorganismos. En contraste, los sistemas continuos de microbiorreactores agitados ofrecen la posibilidad de una experimentación rápida y rentable de alto rendimiento. Los cultivos continuos paralelos pueden llevarse a cabo en un sistema de biorreactor de agitación paralela continua (CosBios) presentado por Akgün. La alimentación de una bomba peristáltica multicanal se aplica en este sistema. Se obtiene un gran número de datos experimentales en un experimento si se ajustan diferentes condiciones de operación en los recipientes de cultivo agitados en paralelo. Se demostró que los resultados de los cultivos de S. cerevisiae en este sistema concuerdan bien con los resultados obtenidos en un biorreactor de tanque agitado de 1 litro operado de manera continua. La concentración de biomasa de un cultivo continuo de C. glutamicum en el sistema de biorreactor CosBios se representa sobre la tasa de dilución. Hasta una tasa de dilución de aproximadamente 0,38 h − 1, el valor de la concentración de biomasa es constante en 5 g l − 1y la concentración de glucosa está cerca de 0gl − 1. A tasas de dilución más altas, el lactato se forma debido a la limitación de oxígeno. Simultáneamente, la concentración de biomasa disminuye y la concentración de glucosa aumenta debido a la reducción del crecimiento microbiano en la limitación de oxígeno. Recientemente, el sistema de biorreactor continuo agitado en paralelo se extendió y se aplicó con éxito en cultivos repetidos de bacterias para la producción de vinagre. Se demostró que los sistemas permitían un cultivo totalmente automatizado y rentable de ocho cultivos en lote repetidos paralelos.

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Alimentación por lotes y operación continua de micro-biorreactores

Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Ambos modos de operación se utilizan para superar la inhibición del sustrato, la represión catabólica o el metabolismo de desbordamiento. El suministro limitado de sustrato es adecuado para evitar la limitación de oxígeno a altas densidades celulares. Además, las condiciones óptimas para el crecimiento y la formación del producto se pueden ajustar mediante la aplicación apropiada del modo de operación de alimentación por lotes. Finalmente, un problema a menudo subestimado en la detección es el crecimiento no paralelo de cultivos discontinuos debido a un protocolo de tiempo fijo. Los modos de operación de alimentación por lotes son adecuados para igualar el crecimiento en precultivos y, posteriormente, para asegurar la misma condición de cultivo inicial para los microorganismos en los cultivos principales. A diferencia de las condiciones de los lotes alimentados en los procesos de producción, los experimentos de selección en microbiorreactores se realizan comúnmente en modo de lotes. La diferencia fundamental entre ambos modos de funcionamiento puede llevar a una selección errónea de las deformaciones. Como consecuencia, las modificaciones del proceso pueden llegar a ser necesarias en un momento posterior y el desarrollo del proceso será menos eficiente. Para superar este problema, actualmente se desarrollan e investigan sistemas de detección de lotes alimentados.

Alimentación controlada por difusión del microbiorreactor

Una forma técnicamente simple y rentable de proporcionar condiciones de cultivo de lotes alimentados en pequeña escala es la liberación controlada de difusión de sustratos en el caldo de cultivo. La ventaja de los sistemas impulsados por difusión es que no se necesitan equipos técnicos adicionales, como bombas y válvulas. Este enfoque es aplicable a cualquier valor de pH.  Jeude y otros investigadores presentaron una técnica de selección paralela para microbiorreactores basados en discos de elastómeros que se cargaron con glucosa. La glucosa sólida se incrusta en una matriz de silicona y el disco de polímero se agrega al caldo de cultivo. Si el agua se difunde en la matriz de silicona, la glucosa disuelta se difunde fuera del elastómero de silicona y el sustrato se libera en el caldo de cultivo. La liberación del sustrato se ajusta por la concentración del sustrato en el elastómero, las propiedades de la silicona y la geometría del disco. Este sistema se aplicó con éxito en matraces de agitación y placas de microtitulación. Se demostró que el metabolismo de desbordamiento de Hansenula polymorpha podía reducirse y se alcanzó un aumento del rendimiento de biomasa del 85%. Además, la formación de GFP aumentó 35 veces en el medio mineral Syn6-MES e incluso 420 veces en el medio mineral YNB en comparación con los cultivos discontinuos con la misma cantidad de glucosa totalmente metabolizada. Se utiliza un diseño ligeramente diferente de este sistema de alimentación en placas de 96 pocillos, en las cuales la matriz de silicona se fija en el fondo de cada pozo. Con ese sistema se han llevado a cabo exitosos cultivos de H. polymorpha en lotes alimentados. En lugar de glucosa, Scheidle encapsuló carbonato de sodio Na2CO3 en la matriz de silicona para controlar el valor de pH en cultivos de E. coli en matraces de agitación. Además, otros sustratos sólidos se pueden incrustar en la matriz de elastómero.  Sin embargo, los líquidos, como por ejemplo el glicerol, no pueden ser alimentados. Un enfoque técnico similar para la alimentación de sustratos fue utilizado por Hegde. Los discos de hidrogel, hechos de hidrogel de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), se cargaron con glucosa e hidrolizado de proteínas para el cultivo alimentado por lotes de células CHO en matraces de agitación.

Bähr presentó un enfoque técnico diferente para la liberación de sustratos controlada por difusión. Este sistema de biorreactores consiste en un matraz de agitación para diálisis, compuesto por un matraz Erlenmeyer convencional y un depósito de sustrato tubular central. El depósito de sustrato se coloca en el centro del tapón de rosca. Al final, el depósito de sustrato se sella con una membrana fijada en una punta. La membrana gira sincrónicamente con el líquido dentro del matraz durante la agitación, y por lo tanto, se asegura el contacto permanente entre la membrana y el líquido. La alimentación de líquidos y sustratos sólidos disueltos es posible con ese sistema. La velocidad de difusión del sustrato se puede ajustar por la concentración de alimentación del sustrato y la geometría y las propiedades de la membrana. Otro sistema de alimentación impulsado por difusión es la placa de microtitulación de alimentación por lotes desarrollada recientemente. En esa placa de microtitulación, la mitad de los pozos sirven como depósitos de sustrato, mientras que la otra mitad sirve como pozos de cultivo. Un depósito de sustrato está conectado a un pozo de cultivo a través de un canal de hidrogel. Se utiliza una placa inferior especial con canales, en la que se llena el hidrogel. El sustrato se difunde desde el depósito de sustrato hacia el canal de hidrogel y, además, hacia el pozo de cultivo. La velocidad de difusión depende de la concentración de alimentación del sustrato, la geometría del canal y las propiedades del hidrogel. Una ventaja de este sistema  es que el tiempo, que necesitan las moléculas de sustrato para pasar el hidrogel, se puede ajustar mediante la elección adecuada de la longitud del canal. De este modo, se puede definir el momento en que comienza la alimentación del sustrato de los microorganismos. Este sistema de alimentación, aplicable para casi cualquier sustrato, fue probado con éxito en cultivos de E. coli y H. polymorpha.

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Robótica para Microbiorreactores

En los últimos años, los experimentos de detección altamente automatizados ganaron cada vez más importancia en los laboratorios de investigación y la industria. La determinación cuantitativa de los parámetros del proceso es una tarea fundamental para optimizar las cepas y las condiciones de cultivo durante el desarrollo de bioprocesos. Sin embargo, el número de posibles combinaciones de parámetros crece exponencialmente con cada parámetro adicional. La automatización del manejo del microbiorreactor puede reducir en gran medida el esfuerzo de trabajo y ampliar el rango de variables de proceso a examinar. Se puede realizar un gran número de experimentos paralelos con una tasa de errores experimentales minimizada y una alta precisión combinando sistemas robóticos con dispositivos de cultivo de microbiorreactores de alto rendimiento. El sistema robótico realiza fácilmente la toma de muestras, los análisis analíticos, el procesamiento posterior o la preparación de medios. Para determinar parámetros de proceso importantes y reducir costos, se aplica el diseño de experimentos. Las investigaciones más recientes sobre la automatización de los reactores microbiológicos tratan sobre la replicación de toda la cadena de procesos en bioprocesos a pequeña escala.

En los últimos años se han publicado varias investigaciones sobre la automatización de los reactores microbiológicos. Puskeiler integró un biorreactor miniaturizado agitado y un lector de placa de microtitulación en un sistema de manejo de líquidos. Las muestras se toman automáticamente y se pipetean en una placa de microtitulación de muestra en una unidad de refrigeración. Un brazo robótico transfiere la placa al lector para los análisis en línea y la coloca para su reutilización después del lavado. El control del pH se realiza mediante la adición de una solución de titulación. Zimmermann y Rieth presentaron un sistema de cultivo completamente automatizado encerrado en una cámara con control de temperatura y humedad que permite el cultivo de 768 experimentos en paralelo. Este sistema cubre todos los pasos desde la preparación, el cultivo, el monitoreo mediante mediciones de fluorescencia en un lector de placas externo, el procesamiento posterior (centrifugación) y el almacenamiento (congelador). Incluso el sellado estéril de las placas de microtitulación se realiza automáticamente mediante el sistema robótico. presentó un sistema totalmente automatizado con autoclave integrado y almacenamiento de soluciones de almacenamiento.

Para evitar interrupciones en el proceso de cultivo durante la toma de muestras, Huber desarrolló un sistema de cultivo automatizado que combina un sistema de manejo de líquidos, un gabinete de flujo de aire laminar y un dispositivo BioLector para mediciones de luz dispersa y fluorescencia en línea en cultivos de placas de microtitulación. Una gran ventaja de este sistema es el cultivo continuo sin interrupción durante las mediciones ópticas. Por lo tanto, la calidad de los datos aumenta y se puede obtener una gran cantidad de parámetros de proceso en poco tiempo. Este sistema se utilizó para realizar la inducción automatizada basada en la concentración de biomasa de diferentes cultivos de E. coli para asegurar un estado de crecimiento idéntico de todos los cultivos microbianos. Así, incluso en diferentes cinéticas de crecimiento de los microorganismos, la formación del producto al final del cultivo fue comparable entre sí.

La desviación de la formación del producto se redujo a ± 7%. Para mejorar la productividad de los microorganismos, se utilizaron perfiles de inducción con diferentes concentraciones de inductor y tiempos de inducción. Además, se pueden compensar diferentes cinéticas de crecimiento de los precultivos calculando individualmente los volúmenes de precultivo requeridos para la inoculación. Rohe combinó un sistema de manejo de líquidos con un dispositivo biolector pero extendió el sistema mediante la integración de un bastidor de enfriamiento, un lector de placas y una centrífuga de placa de microtitulación. Toda la configuración se incluyó en un gabinete de flujo de aire laminar. El sistema de cultivo automatizado se utilizó para la optimización de la producción secretora de una cutinasa por C. glutamicum. A pesar de que muchos parámetros de proceso se pueden determinar hoy en pequeña escala, la funcionalidad completa para imitar las condiciones del proceso a gran escala, como por ejemplo, la medición del pH en todo el rango, los valores de kLa muy altos (> 1500 h-1) o la alimentación y el control de cualquier sustancia, no se entrega hasta ahora.

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Diseño de novedosos microbiorreactores agitados y burbujeados.

En los últimos años, se han desarrollado y publicado diferentes biorreactores miniaturizados en la literatura. Además de los sistemas agitados, como los matraces o las placas de microtitulación, se han investigado otros sistemas, como los sistemas agitados y aireados por burbujas. En varias revisiones y artículos de investigación [2, 5, 7, 69-71] se ofrece una descripción general amplia y completa de los últimos desarrollos. En este capítulo, se presenta un resumen de biorreactores miniaturizados agitados, con burbujas aireadas o agitados con volúmenes <100 ml.

Los sistemas de reactores microbianos agitados tienen algunas ventajas generales. Proporcionan un entorno homogéneo, que ofrece la posibilidad de monitorear de manera integral los parámetros importantes del proceso en línea durante el cultivo. Además, los biorreactores con agitación proporcionan varias opciones para aumentar la mezcla y la transferencia de masa. Según la reproducibilidad de diseño cerrado y la calidad de la medición, los resultados son generalmente altos en sistemas de reactores microbianos agitados. Sin embargo, los microbiorreactores agitados son a menudo costosos y poco adecuados para la experimentación de alto rendimiento. Uno de los primeros biorreactores agitados miniaturizados se informó en 2001. Este microbiorreactor de bajo costo consiste en una cubeta de poliestireno de 4 ml con un volumen de trabajo de 2 ml. Se integraron los optodos para la tensión de oxígeno disuelto (DOT) y las mediciones de pH, una medición de OD y una barra de agitación magnética. Se han alcanzado velocidades de agitación de hasta 300 rpm y valores de kLa de hasta 21 h − 1 en el cultivo de Escherichia coli. En 2003, Lamping publicó un biorreactor de turbina Rushton de 10 ml. El sistema es accionado mecánicamente por un motor eléctrico microfabricado y la aireación se logra con un rociador de tubo único. Por medio de fibra óptica, se realizaron mediciones de DOT, pH y OD. Se alcanzaron valores de kLa hasta ∼ 360 h−1en el sistema agua-aire, pero, para el cultivo de E. coli, se informan valores de hasta 128 h−1. Este sistema de microbiorreactor se caracterizó luego de manera integral en términos de coeficiente de transferencia volumétrico de oxígeno y tiempo de mezcla en un amplio rango de velocidades del impulsor.

Además, la entrada de potencia se determinó mediante mediciones de entrada de potencia eléctrica. Yang y otros usaron un biorreactor agitado miniaturizado con 12 ml de volumen de llenado para los análisis de flujo metabólico. Se aplicó una interfaz de entrada de membrana de perfluoroalcoxialcano para conectar el biorreactor a un espectrómetro de masas para estudios de trazadores 18O para determinar la actividad respiratoria y los flujos metabólicos durante el cultivo de Corynebacterium glutamicum. También se instaló una sonda de pH para determinar el pH. Puskeiler presentó un sistema de biorreactor de poliestireno agitado y miniaturizado, que permite hasta 48 experimentos paralelos. A un volumen de llenado de 8 ml, se alcanzaron valores de kLa de aproximadamente 1600 h−1a una velocidad de agitación de 2300 rpm. Mediante la integración en un sistema robótico de manejo de fluidos, se realizaron el control del pH, las mediciones de OD y la operación de alimentación por lotes. Más tarde, se integró un sensor DOT en estos sistemas. Betts y Baganz informan sobre un prototipo de un biorreactor de tanque agitado miniaturizado de 18 ml. Equipado con medición DOT y pH, se alcanza un valor de kLa de 480 h−1a 7000 rpm. Klein presentó un sistema a pequeña escala de ocho tubos Hungate paralelos con un volumen de trabajo de 10 ml. El sistema funciona como un quimiostato y permite la monitorización de CO2y la medición DOT. Se alcanzó kLa de 48.5h−1a 2000 rpm.

Si solo se requiere un suministro moderado de oxígeno, una alternativa interesante a los microbiorreactores con agitación son la columna de burbujas o los microbiorreactores agitados. Ambos tipos de biorreactores son técnicamente simples y rentables. Doig desarrolló un reactor de columna de burbujas en miniatura con un volumen de trabajo de 2 ml que alcanzó valores de kLa de 220 h−1. El sistema permite mediciones ópticas de DOT y pH. En 2006, se introdujo el sistema Micro 24 (𝜇24), que es un biorreactor de columna de burbuja miniaturizado agitado basado en una placa de microtitulación con sensor de temperatura DOT y pH óptico integrado y sensor de temperatura de conductor térmico. El control individual de pH, DOT y temperatura en cada pozo es posible. El sistema basado en placa de microtitulación disponible comercialmente con DOT y medición de pH y control de temperatura fue probado por Isett con cultivos de E. coli, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Se alcanzó kLa de 56 h−1a 800 rpm.

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Estrés hidromecánico en biorreactores

La entrada de potencia de un biorreactor no se introduce uniformemente en el líquido a granel. En algunos puntos de los biorreactores se produce una entrada de alimentación local más alta, mientras que en otros lugares se observa una entrada de alimentación local reducida. La potencia máxima local de entrada (P / VL) max es un parámetro que indica el nivel de estrés hidromecánico al que están expuestos los microorganismos. En general, el daño celular no es un fenómeno definido con precisión. Incluye la alteración de los tamaños de agregados, la liberación de compuestos intracelulares, la variación de las tasas de respiración específicas, la pérdida de viabilidad, la reducción de la producción de biomasa y, finalmente, los cambios en la composición de la pared celular. Para evitar estos efectos, se debe evaluar la cantidad de estrés hidromecánico en los biorreactores. En particular, si está presente una segunda fase líquida de una fuente de carbono orgánico, como aceite vegetal, alcanos o productos químicos insolubles en agua, se debe conocer el nivel y la distribución espacial del estrés hidromecánico para caracterizar suficientemente un bioproceso. Si bien las bacterias son en general bastante robustas, las células animales o los organismos de crecimiento filamentoso, como los hongos, pueden ser más sensibles al estrés hidromecánico. El nivel de esfuerzo hidromecánico dentro del biorreactor depende de las condiciones de operación prevalecientes, el diseño del biorreactor y las propiedades del líquido, como la viscosidad. La respuesta microbiana al estrés hidromecánico varía, dependiendo de las propiedades celulares particulares, como el tamaño y la rigidez de la pared de las células. Las células animales son generalmente sensibles al estrés hidromecánico debido a su tamaño relativamente grande y la falta de una pared celular protectora. Mientras que los biorreactores agitados muestran una entrada de potencia local relativamente baja, la entrada de potencia local en biorreactores de tanque agitado en la misma entrada de potencia específica es aproximadamente un factor de 10 a 20 más alta en comparación con los matraces de agitación. Cabe señalar que la entrada de potencia promedio (P / VL) ø en biorreactores agitados y agitados en condiciones normales de operación está en un rango similar. En consecuencia, la entrada de potencia se introduce más uniformemente en biorreactores agitados que en biorreactores de tanque agitado. Este hallazgo corresponde a la observación durante los cultivos de células hidromecánicamente sensibles en ambos tipos de reactores, en los que se han observado diferentes morfologías. Además de la entrada de energía local en el líquido a granel generado por el agitador, la explosión de burbujas en la superficie del líquido contribuye en gran medida al estrés hidromecánico de las células de los mamíferos en biorreactores aireados. Si las burbujas explotan en la superficie del líquido, se extraen pequeñas gotas de la superficie y se generan altas densidades de energía. En particular, las células animales sensibles podrían dañarse debido a la explosión de la burbuja.

Este efecto está completamente ausente en matraces de agitación desbalanceados aireados en la superficie donde no se generan burbujas.

La influencia de la aireación en biorreactores de tanque agitado en el estrés hidromecánico de microorganismos se investigó recientemente. Se encontró que la tasa máxima de disipación de energía local se reduce en más del 50% en presencia de aire en comparación con las condiciones sin aire y la entrada de potencia específica igual. El factor de reducción exacto depende de la geometría específica del impulsor Rushton de 6 palas aplicado. Curiosamente, se observa una entrada de potencia máxima similar en un matraz de agitación desbalanceado y desconcertado si se ajusta la misma entrada de potencia específica promedio. Peter et al. presentó una correlación para calcular la tasa máxima de disipación de energía local 𝜀max en matraces de agitación desbalanceados en función del régimen de flujo y las condiciones de operación. Los autores determinaron la transición del régimen de flujo no turbulento a turbulento en matraces de agitación desbalanceados a un número de Reynolds de Re> 60 000. Para comprender mejor el efecto del estrés hidromecánico en los microorganismos y obtener una mejor comparabilidad entre el matraz de agitación y los biorreactores de tanque agitado, se deben realizar más investigaciones en el futuro.

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