Biorreactores continuos para cultivo de células madre atrapadas

Células madre

Cuando las células madre atrapadas se cultivan en sistemas discontinuos, la fuerza impulsora para la entrada de nutrientes y la salida de metabolitos en la construcción de material que contiene las células madre disminuye continuamente. En sistemas continuos con retención de células, esta fuerza impulsora se puede mantener casi constante. Hay dos tipos generales de biorreactores que se pueden utilizar en una operación continua: mezclados “perfectamente” y de flujo pistón. Un ejemplo de un biorreactor perfectamente mezclado es un reactor de tanque agitado continuo (CSTR) con un mecanismo de retención de células, mientras que una configuración de reactor de flujo de pistón (PFR) correspondería a una construcción que contiene células, que es parte de un fluido circuito que fluye a través del material poroso que contiene las células. La configuración PFR permite que el medio fresco sea forzado dentro de la estructura porosa del andamio, creando así un flujo convectivo, que minimiza las distancias de difusión mientras se mantiene por debajo de los valores críticos de velocidad de corte. Además, este tipo de flujo es muy eficaz para sembrar las células en los andamios al comienzo del cultivo de células madre atrapadas. El trabajo de Wendt estableció una comparación entre matraces giratorios de placas de pocillos (estáticos) (agitados) y una siembra de células de condrocitos PFR (perfundida). Estos autores demostraron que el sistema PFR permitió una siembra celular significativamente más uniforme y eficiente. También se demostró que las células del estroma de la médula ósea se distribuyen de manera más uniforme en armazones cerámicos cuando se utiliza la siembra perfundida, en comparación con el control estático. Es importante recordar que las construcciones que pueden ser perfundidas por PFR son porosas, es decir, este sistema de cultivo no es apropiado para andamios de hidrogel, que tienen una permeabilidad hidráulica menor.

El principal inconveniente de los reactores PFR es la dificultad para medir y controlar el pH y el OD dentro del andamio; además, es muy difícil medir el crecimiento celular, lo que hace que la optimización de estos procesos sea mayoritariamente empírica. Estos problemas pueden minimizarse teniendo tiempos de residencia bajos (1 – 10 s) del medio de cultivo en el armazón y monitoreando los parámetros en la salida mientras se aplica el control en la entrada. El requisito de tener tiempos de residencia bajos en el PFR implica que la longitud de la construcción perfundida por el medio de cultivo se mantiene dentro de la escala milimétrica, lo que hace que el sistema sea difícil de escalar. La mayoría de los sistemas PFR utilizados en cultivos de células madre atrapadas tienen una recirculación media en un depósito, lo que aumenta el tiempo de residencia general de todo el sistema a varios días, es decir, cerca de los niveles de CSTR. Por lo tanto, mientras que la transferencia de masa en la construcción es convectiva, el medio de cultivo total utilizado se mantiene al mismo costo que un CSTR. En general, los sistemas PFR no se pueden ampliar a escala, pero proporcionan las condiciones adecuadas para sembrar y cultivar células madre atrapadas para un producto terapéutico autólogo. De hecho, la falta de sensores en cualquier sistema de procesamiento cerrado simplifica el problema regulatorio ya que para cada sensor hay un modo de falla asociado, o riesgo, que necesita ser mitigado. Por estas razones, la principal aplicación terapéutica de este reactor continuo ha sido la ingeniería de tejido óseo autólogo.

Los reactores continuos de tanque agitado, a diferencia de los PFR, tienen tiempos de residencia más altos (1 a 4 días) y la transferencia de masa dentro del material es difusional, lo que limita el tamaño de los andamios a cientos de micrómetros para minimizar el dC ∕ gradientes. Por el contrario, es posible tomar muestras del caldo de cultivo y así medir el crecimiento celular y la composición del medio de cultivo. La medición y el control de pH y OD se realizan en el caldo de cultivo que se mezcla homogéneamente, es decir, se conoce el OD y el pH en las proximidades del armazón. Otra ventaja del CSTR en comparación con los PFR es su escalabilidad. Al considerar las terapias celulares alogénicas, donde la escalabilidad permite el establecimiento de economías de escala, un CSTR tiende a ser la opción más apropiada para obtener un gran número de células bajo un sistema controlado. El grupo Zandstra de la Universidad de Toronto ha demostrado que un CSTR evita la fluctuación de la composición del medio de cultivo entre intercambios de medio discretos en la expansión de mESC encapsulada en alginato; Una ventaja que a menudo se pasa por alto de los sistemas continuos sobre los intercambios de medios discretos es que evita las tensiones del proceso, como interrumpir la agitación, para permitir que las construcciones se asienten antes de reemplazar el medio.

Uno de los aspectos más difíciles al comparar el rendimiento de diferentes configuraciones de reactores es el acoplamiento entre la transferencia de masa y el tiempo de residencia. En un PFR, la transferencia de masa y el tiempo de residencia están acoplados porque la tasa de flujo del medio de cultivo (o la velocidad superficial = tasa de flujo ∕ área del andamio) proporciona tanto el intercambio de medios como el transporte de masa convectivo. En un CSTR, la transferencia de masa se desacopla del tiempo de residencia porque la rotación del impulsor proporciona la transferencia de masa, mientras que la tasa de flujo de perfusión proporciona el tiempo de residencia (o tasa de reemplazo media). Teniendo en cuenta este tema, algunos autores han comparado el efecto de los diferentes mecanismos de transferencia de masa en un reactor de tipo PFR, un recipiente de tanque agitado, un recipiente de pared giratoria y un reactor biaxial (BXR) con el mismo tiempo de residencia entre los cuatro reactores para humanos cultivo de MSC fetal en un andamio de policaprolactona-fosfato tricálcico (PCL-TCP). Los resultados mostraron que el BXR produjo más células a una tasa de crecimiento más rápida con más formación de hueso ectópico en ratones inmunodeficientes en comparación con los otros tres tipos de reactores. Curiosamente, los autores también han notado la presencia de «orificios de perfusión» en el reactor PFR, lo que plantea la hipótesis de que el andamio podría degradarse mecánicamente por el flujo de fluido en este tipo de reactor. Se había demostrado anteriormente que el BXR mejora el flujo de fluido dentro de los andamios de 20 a 40 veces, debido a su movimiento bidireccional, mientras mantiene los niveles de esfuerzo cortante por debajo de 2 Pa y es una de las innovaciones más recientes en el campo de los biorreactores continuos.

Muchos de los principios del bioprocesamiento de proteínas recombinantes han sido adoptados por el incipiente campo del bioprocesamiento de células madre; en la producción de proteínas recombinantes, cuando las células se cultivan en un biorreactor continuo con retención celular, cuanto mayor es el flujo, mayor es el crecimiento de las células, ya que el objetivo principal es eliminar los metabolitos y agregar nutrientes al cultivo celular; típicamente, la tasa de flujo de perfusión solo está limitada por las tensiones adicionales del proceso que se originan en el mecanismo de retención celular o la dilución del producto secretado. En el bioprocesamiento de células madre atrapadas, aunque todavía es necesario agregar nutrientes y eliminar metabolitos, también puede ser importante retener factores solubles o proteínas ECM que son producidas por las células que tienen un efecto positivo en el tipo de célula final deseado. Esta idea ha sido demostrada por Junho y Ma mediante la construcción de un sistema de biorreactor donde un andamio poroso de tereftalato de polietileno (PET) sembrado con hMSC se cultivó con medio perfundido a través del andamio o tangencialmente a él, proporcionando así una transferencia de masa por convección o difusión en el interior el andamio, respectivamente. Al comparar estos sistemas entre sí, se encontró que el sistema de perfusión tangencial favorecía la expansión de hMSC indiferenciadas, mientras que el cultivo de perfusión de flujo continuo estaba enriquecido en marcadores osteogénicos como BMP-2, ALP y RUNX2. Los autores han correlacionado aún más este destino celular diferencial con un aumento en las proteínas ECM fibronectina, vitronectina y colágeno tipo I en el flujo tangencial. Por tanto, para diferentes destinos celulares, las limitaciones de difusión de la transferencia de masa pueden ser beneficiosas o perjudiciales.

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La agarosa – polisacáridos en el cultivo de células madre

agarrosa

Los polisacáridos en el cultivo de células madre son, al igual que las proteínas, un componente natural de la ECM. La principal ventaja de los polisacáridos sobre las proteínas es que los monómeros de partida son más pequeños y, por tanto, más fáciles de manipular y esterilizar. En su forma no modificada, estos carbohidratos no se unen a las células. En cambio, obligan a las poblaciones celulares a formar contactos célula-célula una vez que estos están contenidos dentro del material.

La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta extraído de algas o algas marinas y está compuesto estructuralmente por los monómeros D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactopiranosa. Históricamente, se ha utilizado para la electroforesis de ácidos nucleicos. Cuando la agarosa se disuelve en una solución acuosa, se puede solubilizar calentando la mezcla; una vez que esta mezcla se enfría a la temperatura de gelificación, se vuelve sólida. Para resolubilizar el gel, es necesario calentarlo a la temperatura de fusión, que es significativamente más alta que la temperatura de gelificación.

Se utilizan geles de agarosa con baja temperatura de gelificación / fusión para hacer que este proceso sea compatible con el atrapamiento celular, y al cambiar la concentración de agarosa en la mezcla final es posible ajustar la rigidez del material.

Se demostró que el cultivo de hMSC en geles de agarosa al 2% (p / v) era tan eficaz como el cultivo de sedimentos estándar de oro para la diferenciación condrogénica de estas células madre. La diferenciación condrogénica de MSC en geles de agarosa al 2% también fue estudiada por Mauck et al .; En este caso, las células quedaron atrapadas en discos de 4 × 1,5 mm (diámetro x espesor) y sometidas a una carga de compresión cíclica, lo que resultó en un aumento en la cantidad de glicosaminoglicanos (GAG) producidos después de 4 semanas, en comparación con un control sin carga. Este último trabajo ejemplifica la importancia de las fuerzas aplicadas a los cultivos de células madre y cómo se pueden utilizar los biomateriales para permitir tales procesos.

Los alginatos son polímeros compuestos por residuos de 𝛽-D-manuronato (M) y 𝛼-L-guluronato (G), que se extraen de las algas pardas. Sus ventajas y proceso de extracción son similares a la agarosa, pero el alginato forma una solución viscosa aniónica que gelifica solo en presencia de cationes divalentes como calcio o bario (los agentes reticulantes). El efecto del alginato en el procesamiento de células madre ha sido estudiado a fondo donde las hESC se cultivaron como esferoides multicelulares 3D o adherentes a microportadores en vasos giratorios. Estas dos configuraciones de cultivo se compararon por su capacidad para expandir hESC indiferenciadas con o sin encapsulación en alginato al 1,1%. Los resultados mostraron que sin la encapsulación de alginato los agregados de hESC no sobrevivieron durante el período de cultivo de 2 semanas. Para las hESC inmovilizadas en microvehículos, la encapsulación de alginato produjo un aumento del 40% en el número final de células.

Los resultados de esta matriz experimental sugieren que, si bien se sabe que el esfuerzo cortante es perjudicial para los cultivos de ESC, el efecto principal de la encapsulación de alginato es la individualización de las “unidades” de cultivo (ya sean agregados o microportadores). En ausencia de encapsulación de alginato, estas unidades se agrupan, lo que conduce a la muerte celular en los agregados y a una proliferación limitada en los microportadores debido a las limitaciones de nutrientes en el núcleo de las unidades agregadas. En otro trabajo, los armazones de agarosa y alginato se compararon con un armazón comercial de gelatina (una forma de colágeno), Surgifoam®, por su capacidad para diferenciar las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC) en cartílago. Las células tendieron a adherirse y extenderse en el armazón de gelatina, adoptando una configuración alargada, mientras que en el armazón de agarosa y alginato las células permanecieron redondeadas y solo interactuaron entre ellas.

Las células tendieron a adherirse y extenderse en el armazón de gelatina, adoptando una configuración alargada, mientras que en el armazón de agarosa y alginato las células permanecieron redondeadas y solo interactuaron entre ellas. Esto condujo a diferencias significativas en el tipo de cartílago obtenido al usar gelatina en comparación con los materiales derivados de las algas. Estos resultados se pueden generalizar para resaltar la diferencia entre los materiales bioactivos que interactúan físicamente con las células madre y los materiales para los procesos en biorreactores que son biológicamente inertes, como es el caso de la agarosa (no modificada) y el alginato.El hialurano (o ácido hialurónico, HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado, ubicuo en toda la ECM y similar al colágeno, tiene una baja reactividad inmunológica y es biodegradable. Está constituido por monómeros de N -acetilglucosamina y ácido glucurónico, estimula la proliferación y migración celular, y tiene una distribución enriquecida en el embrión de mamífero, razón principal de su aplicación al cultivo de células madre. El hialurano se ha utilizado en la industria médica para el tratamiento de la osteoartritis (OA) como reemplazo del líquido sinovial de baja elasticidad de los pacientes con OA. Esta práctica médica establecida está siendo modificada para la regeneración de discos no vertebrales usando terapia celular, donde las células precursoras mesenquimales humanas (comercializadas por Mesoblast, AU) se inyectan con hialuronano para reparar los discos dañados.

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Atrapamiento de células madre con colágeno y seda

Las proteínas de origen natural ofrecen la oportunidad de imitar en los biorrectores el microambiente in vivo que experimentan las células madre con una modificación química limitada (o ausente). La proteína más abundante en el cuerpo de los mamíferos es el colágeno, y su función principal in vivo es proporcionar rigidez a la matriz extracelular; el enlace entre las células y el colágeno puede ser directo o puede lograrse a través de la molécula de fibronectina, que une el colágeno y la integrina de la molécula de la superficie celular a través del motivo RGD. Las isoformas de colágeno I, II, III y V son proteínas fibrosas ubicadas en el área intersticial de los tejidos, mientras que el colágeno IV es parte de la capa basal de la mayoría de los tejidos epiteliales. Como biomaterial, el colágeno es biodegradable, biocompatible, tiene baja inmunogenicidad y se puede extraer de prácticamente cualquier mamífero. Su principal desventaja es la dificultad de esterilización, similar a cualquier otro material a base de proteínas, ya que el vapor y la radiación pueden cambiar fácilmente la conformación de la proteína. En el caso del colágeno, el tratamiento con ácido es el método de esterilización más común, mientras que la inmersión en etanol también es una alternativa.

El colágeno de tipo I es la isoforma que se utiliza en la gran mayoría de aplicaciones de cultivos celulares; estos incluyen cultivos de células madre neurales, hMSC y ESC de ratón. En el último trabajo, Battista y colaboradores, han demostrado que los cuerpos embrioides (EB) de células madre embrionarias de ratón (mESC) diferenciados se inhiben con concentraciones crecientes de colágeno, probablemente debido a una rigidez creciente de los geles. El efecto de la tensión uniaxial sobre la diferenciación osteogénica de hMSC fue demostrado por Sumanasinghe, para aumentar la expresión génica de la proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2) en un 10% en comparación con el control no tensado. El mejor ejemplo de una aplicación comercial que involucra colágeno es los productos de medicina regenerativa para la cicatrización de heridas cuya formulación incluye colágeno.

La fibrina es una proteína que interviene en la coagulación de la sangre; se forma cuando la trombina interactúa con el fibrinógeno y forma el polímero de fibrina. Esta proteína es ideal para aplicaciones terapéuticas ya que sus materias primas se pueden extraer de la sangre de un paciente para realizar la síntesis de fibrina ex vivo, que constituye un producto autólogo degradable que no debería provocar una respuesta inmune cuando se reimplanta en el paciente.

La literatura reporta varias aplicaciones terapéuticas de geles de fibrina para defectos óseos usando hMSC y más recientemente Falanga et al. han informado de la aplicación de una mezcla de hMSC con fibrina en un aerosol para la cicatrización de heridas. Esta proteína también se ha utilizado para la diferenciación neuronal de mESC y para construir válvulas cardíacas artificiales que contienen miofibroblastos humanos primarios.

El uso de la seda como material se originó en la industria textil (que produce alrededor de 4 × 105 toneladas de seda al año) y ha migrado al campo médico hace décadas cuando comenzaron a usarse las suturas de seda. La proteína de la seda es una de las más resistentes de la naturaleza y su módulo de Young varía de 5 a 17 GPa (en comparación con el colágeno que tiene 2 a 50 MPa). La principal ventaja de la seda sobre los biomateriales naturales restantes es que la esterilización con vapor y la irradiación gamma no cambian su estructura. Dada su rigidez, este material, funcionalizado con el péptido RGD, ya se ha utilizado para la diferenciación osteogénica de hMSC y se ha demostrado que regula al alza la expresión de marcadores óseos en comparación con el colágeno. El cultivo y la diferenciación condrogénica de hMSC también se logró en andamios de seda porosa 3D, y también se ha demostrado la expansión indiferenciada de este tipo de células en nanofibras de seda electrohiladas.

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Materiales – Péptidos y Cerámica

Los péptidos se componen de secuencias cortas de aminoácidos y típicamente se sintetizan en una reacción química estandarizada en fase sólida entre los extremos C-terminal y N-terminal de los aminoácidos. Zhang y col. sintetizó un péptido que consta de una secuencia alterna de aminoácidos cargados positiva y negativamente con cadenas laterales hidrófobas e hidrófilas alternas; este péptido, llamado RADA16 por su secuencia de aminoácidos, tiene la capacidad de autoensamblarse en láminas 𝛽 estables con una estructura fibrilar muy cercana a la ECM y con un contenido de agua del 99%.

La geometría del material puede variar desde una capa membranosa hasta andamios de hidrogel, que apoyan el crecimiento y la diferenciación de progenitores de hepatocitos y células madre neurales.

En el último trabajo, Zhang han funcionalizado aún más el andamio RADA16 a través de la unión covalente de la secuencia del péptido Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), que se encuentra en la laminina y también se une a los receptores de integrina. La última aplicación comercial de este material es la superficie de acrilato de péptido y matraces y perlas de cultivo celular recubiertos. Se cultivaron células madre embrionarias humanas en la superficie y se diferenciaron con éxito en cardiomiocitos.

A diferencia de RADA16, otros productos están compuestos estructuralmente por superficies de acrilato y los péptidos sintéticos, derivados de motivos ECM, se utilizan principalmente para funcionalizar el sustrato para un destino celular determinado, como la diferenciación de hESC en oligodendrocitos.

Los materiales cerámicos están compuestos de materiales inorgánicos que se mezclan con agua y un aglutinante orgánico para hacer el producto cerámico final. Estos materiales se han utilizado históricamente en cirugía ortopédica por su alto módulo de Young (en comparación con otros biomateriales), donde se clasifican como inertes o bioactivos. 

Las cerámicas bioactivas tienen propiedades osteoconductoras que aceleran la curación ósea; estas propiedades se han utilizado para producir armazones cerámicos con osteoblastos derivados de hMSC mediante diferenciación osteogénica. 

Toquet y col. fueron de los primeros en demostrar que era posible expandir las hMSC derivadas de la médula ósea en sedimentos macroporosos de fosfato cálcico y, posteriormente, diferenciar estas células en un destino osteogénico. 

La actividad osteogénica del fosfato de calcio cuando se usa en la diferenciación de hMSC se debe al hecho de que el calcio es un componente principal del hueso, en forma de hidroxiapatita.

Cuando se sembraron andamios cúbicos con una mezcla de 80% -20% de hidroxiapatita y fosfato tricálcico (TCP) con hMSC y se implantaron ectópicamente en ratones, la tasa de formación de hueso fue significativamente mayor que con cualquiera de los materiales individuales.

Estos ejemplos demuestran la importancia de imitar el entorno in vivo y cómo los materiales que entran en contacto con las células son un factor importante para proporcionar tales señales.

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Materiales utilizados en el atrapamiento de células madre.

Los parámetros físicos más críticos de los materiales utilizados en el de atrapamiento de células madre se obtienen en pruebas de tensión-deformación. Estas pruebas han establecido estándares que se pueden encontrar en los sitios web de la Organización Internacional de Normalización (ISO) y la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales (ASTM). Las curvas de tensión-deformación obtenidas de estos ensayos relacionan la fuerza normalizada por unidad de área (tensión) aplicada al material con el desplazamiento relativo resultante del material (deformación). Uno de los parámetros más importantes obtenidos en tales pruebas es el módulo de Young (E, en fuerza por unidad de área), que es la pendiente en la región elástica de la curva tensión-deformación y es una medida de la rigidez del material, que se sabe que afecta la señalización intracelular principalmente a través de los receptores de integrina y las quinasas de adhesión focal asociadas. Recientemente, Engler et al. han demostrado que la rigidez de la matriz puede dirigir la diferenciación del atrapamiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC) a destinos celulares neuronales, miogénicos y osteogénicos, dependiendo de si el sustrato de poliacrilamida tiene una rigidez menor o mayor. Por lo tanto, el módulo de Young es una propiedad mecánica crítica de los materiales utilizados para cultivar células madre.

Estos materiales pueden clasificarse en materiales sintéticos o naturales, y ambos grupos pueden subdividirse en materiales sintéticos basados en polímeros, péptidos y cerámica, y proteínas, polisacáridos y materiales naturales complejos. El uso de materiales sintéticos posee una ventaja sobre los materiales naturales: un mayor grado de control durante el proceso de fabricación que puede simplificar el control de calidad (QC) y los procesos de aprobación regulatoria en el caso de aplicaciones terapéuticas, ya que la composición de los materiales sintéticos es bien definido. Sin embargo, si los materiales naturales son abundantes y el proceso de extracción / preparación / esterilización / eliminación de endotoxinas es simple, la economía del proceso puede ser más favorable en comparación con sus contrapartes sintéticas. Además, los materiales naturales complejos como Matrigel tienen muchas proteínas de matriz extracelular (ECM) y factores de crecimiento incrustados que proporcionan un microambiente muy favorable para el cultivo de células madre. Independientemente de su origen, el uso de materiales en el cultivo de células madre tiene como objetivo principal aumentar la similitud entre el cultivo y los entornos in vivo.

Los polímeros sintéticos ofrecen la posibilidad de controlar la composición, las propiedades químicas y físicas, así como la tasa de degradación del material. El polietilenglicol (PEG) está aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) para su uso como excipiente y conjugado de fármaco, siendo el ejemplo más notable el conjugado de PEG-interferón-𝛼, que aumenta la solubilidad y vida media de la proteína en el cuerpo humano. Los monómeros de diacrilato de PEG sin modificar se polimerizan típicamente mediante irradiación ultravioleta (UV), formando un polímero que tiene baja adhesión celular y baja unión a proteínas, y está completamente hidratado en solución acuosa. La introducción de modificaciones químicas covalentes antes de la reacción de polimerización puede agregar funcionalidades adicionales como la adhesión celular. Por ejemplo, la reticulación del motivo peptídico de unión a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en hidrogeles de PEG aumenta la propagación celular (adhesión) sobre el polímero y la adición de grupos químicos funcionales también se puede utilizar para dirigir la diferenciación de hMSC . La degradación de los hidrogeles de PEG también se puede ajustar reticulando el polímero con enlazadores peptídicos escindibles como lo muestran Anderson et al. quienes demostraron que los hidrogeles de PEG con una tasa de degradación aumentada también aumentan la eficiencia de la diferenciación de hMSC en linajes osteogénicos, condrogénicos y adipogénicos.

El polímero sintético poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) es un copolímero de los monómeros del ácido glicólico y láctico y, similar al PEG, puede funcionalizarse y su velocidad de degradación puede modificarse químicamente. Se utiliza ampliamente en aplicaciones clínicas como material biodegradable aprobado por la FDA de EE. UU. ejemplos de tales aplicaciones son suturas quirúrgicas (Vicryl®, Johnson y Johnson), injertos y dispositivos protésicos. Los nuevos copolímeros resultantes se sembraron con hMSC y se estudió su interacción célula-polímero. Recientemente, Huang et al. han sintetizado perlas porosas de PLGA, que apoyan el crecimiento de células madre del líquido amniótico humano (hAFSC); estas perlas permitieron que las células crecieran tridimensionalmente sin limitaciones de nutrientes y depositaran componentes de ECM como colágeno III y fibronectina. Estas perlas que contenían hAFSC se inyectaron en ratas que habían sufrido un infarto de miocardio, y estos animales mostraron mejoras significativas en la función cardíaca en comparación con los que recibieron células disociadas sin las perlas.

Ha habido un desarrollo significativo en materiales de atrapamiento de células madre en biorreactores hechos de politetrafluoroetileno (PTFE), que es un material comúnmente utilizado en la industria de dispositivos médicos. La aplicación más notable de PTFE al cultivo de células madre atrapadas son las macrocápsulas en combinación con células productoras de insulina derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC).

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Cultivo de células madre atrapadas en biorreactores continuos

Las células madre son células con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en tipos de células maduras y funcionales. Las aplicaciones de las células madre se pueden dividir en dos áreas: como fuentes de células para modelos in vitro (tanto para modelos de enfermedades como para estudios de toxicología) y para terapias celulares. Como modelos in vitro, las células madre se pueden utilizar para desentrañar los mecanismos fundamentales de aparición, progresión y mitigación o curación de enfermedades y como herramienta para las pruebas de toxicidad. En ambos casos, es deseable que las células madre se diferencien en células de interés, que pueden ser células diferenciadas terminalmente (típicamente para pruebas in vitro y en algunos casos para terapias) o progenitoras expandibles (es más probable que se utilicen en terapias).

Como terapias, las células madre son parte de la medicina regenerativa y la terapia celular, con ensayos clínicos en curso en áreas como diabetes, enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y leucemia linfoblástica aguda, entre otros.

El cultivo de células madre se realiza principalmente utilizando superficies planas como matraces en T en incubadoras de temperatura y atmósfera controladas, que no controlan la composición fisicoquímica del medio de cultivo. El uso de biorreactores para el cultivo de células madre tiene dos ventajas principales sobre estos sistemas: permite el seguimiento y control de los parámetros de cultivo como el oxígeno disuelto (OD) y el pH, y permite una escalabilidad más sencilla y directa, que oscila entre cientos de mililitros a 104 l.  Si bien la escalabilidad es fundamental para las terapias con células madre, que requieren un alto número de células y son deseables para la economía del proceso de producción de células madre en general, el control ambiental que permiten los biorreactores es de suma importancia para cualquier cultivo de células madre, ya que estos cultivos ya están afectados por variables relacionadas con la biología celular.

Vale la pena señalar que hay un grado de control decreciente cuando se compara un biorreactor de tanque agitado con la medición y control de OD y pH en el medio de cultivo a granel con un biorreactor de flujo pistón, que puede tener los mismos controles en la entrada del medio y salida pero con conocimiento limitado de los valores de estos parámetros cerca del microambiente celular.

Esta es la razón por la que los cultivos de células madre no escalables (es decir, realizados en matraces T) generalmente requieren un intercambio de medio total o parcial a intervalos de 1 a 4 días, ya sea con fines de expansión o diferenciación. El impacto de estos cambios en la composición del medio de cultivo es proporcional al tiempo de cultivo; es decir, afecta a las culturas de largo plazo más severamente que a las de corto plazo. El uso de un biorreactor continuo añade la composición del medio de cultivo a los parámetros controlados dentro del recipiente y dicho control permite cambiar el medio de cultivo a medida que las células madre progresan hacia un tipo de célula deseado.

El atrapamiento de células madre en un material proporciona un entorno de cultivo tridimensional (3D), que imita el entorno celular in vivo, donde las células están en contacto entre sí y con la matriz extracelular, a diferencia del cultivo en matraz T normal. Además, la necesidad de mezclar y por lo tanto el flujo de fluido en los biorreactores genera cizallamiento; la velocidad de cizallamiento se define como el componente de presión anormal que surge del flujo de fluido. Esto se define como 𝜏= 𝜕v ∕ 𝜕y, donde 𝜏es la tasa de corte y el lado derecho de la ecuación representa el gradiente de cambio del vector de velocidad paralelo a la superficie de la celda con la distancia y desde esta misma superficie. El esfuerzo cortante viene dado por el producto de la velocidad de corte por la viscosidad cinemática de la solución.

El impacto de la cizalladura en la viabilidad, proliferación y diferenciación de las células madre se ha documentado ampliamente, como se comenta más adelante. El atrapamiento de células madre es una tecnología ampliamente utilizada para mitigar estos efectos relacionados con el cizallamiento de los cultivos en biorreactores y, cuando se combina con un medio de alimentación continuo, proporciona un entorno de cultivo de células madre más controlado.

Desde una perspectiva clínica, el material de atrapamiento puede proporcionar una protección física que evita que las células alogénicas sean atacadas por el sistema inmunológico del huésped y también evita que las células implantadas proliferen en el cuerpo del huésped.

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Biorreactores y producción de hPSC

Ampliando la discusión sobre biorreactores en la producción de hPSC en el estado pluripotente, proporcionamos un breve estado de la diferenciación cardiomiogénica ascendente de las PSC. Esto no solo refleja la propia experiencia y conocimientos, sino que también representa uno de los campos más avanzados en la producción en masa de hPSC, lo que refleja el enorme potencial terapéutico y socioeconómico de esta investigación.

En general, se pueden subdividir los procesos de producción secuenciales frente a los integrados. La producción secuencial se refiere al procesamiento independiente de células en estado pluripotente en el primer paso, que luego se diferencian en un segundo enfoque, bastante diferente. Esto podría incluir, por ejemplo, la transición del cultivo 2D para la expansión celular a la diferenciación 3D. Tradicionalmente, las estrategias de expansión celular (descritas anteriormente) se han desarrollado y optimizado independientemente de los protocolos de diferenciación. Por el contrario, el procesamiento integrado tiene como objetivo el desarrollo de enfoques de «un solo paso» estrechamente conectados basados en la transición directa de la producción de hPSC en biorreactores a la diferenciación de linaje. Esto podría establecerse cambiando medios específicos, únicamente, que controlan los diferentes pasos del proceso, pero sin una gran adaptación del entorno del biorreactor.

Para establecer condiciones de cultivo definidas químicamente y reducir significativamente los costos, se probaron moléculas pequeñas como el compuesto SB203580, un potente inhibidor de p38 MAPK. La suplementación de SB203580 a los EB diferenciados en cultivo en suspensión a escala de cultivo tisular resultó en una inducción de hasta un 10% de CM a partir de hESC de una manera dependiente de la concentración, lo que permitió el enriquecimiento a> 99% de pureza mediante selección genética.

Más recientemente, se logró una inducción de cardiomiocitos> 80% a partir de las líneas hESC y hiPSC mediante el uso del inhibidor de GSK3𝛽CHIR99021 que desencadena la activación de la vía WNT. Posteriormente, el protocolo emplea la suplementación de inhibidores químicos de la vía de WNT como IWP o IWR en etapas posteriores, lo que refleja un patrón de actividad de WNT bifásica conocido por el desarrollo del corazón. Inicialmente, el protocolo se desarrolló en un formato de monocapa 2D para la expansión y diferenciación de hPSC, lo que limita su aplicación al aumento de escala en reactores agitados.

Para superar estas limitaciones, hemos establecido recientemente una plataforma multipocillo para el cultivo y la diferenciación de hPSC en placas de 12 pocillos de baja adherencia para facilitar la optimización del proceso en un mayor rendimiento. Al mostrar que la inducción cardíaca dependía estrechamente del paso de tratamiento transitorio de CHIR99021, el trabajo permitió la combinación directa de la expansión de hPSC de agregados inoculados de células individuales con la posterior diferenciación cardíaca en un proceso integrado de “un solo paso”. La ampliación a matraces Erlenmeyer rotados en una escala de 20 ml confirmó la solidez del protocolo y la aplicabilidad a varias líneas establecidas de hESC y hiPSC y apoyó la transición final a reactores de tanque instrumentados y agitados. El proceso integrado en una escala de 100 ml permitió combinar directamente la expansión de hPSC basada en agregados, inoculada en una sola célula, seguida de la inducción de hasta un 85% de CM puros en medios definidos, lo que permite la producción de 40-50 millones de CM en una sola ejecución de proceso. También se aceptó recientemente para su publicación una descripción detallada del procedimiento experimental que incluye todos los pasos para la configuración, calibración y resolución de problemas del biorreactor.

Con su eficiencia actual, el proceso en Biorreactores de producción de hPSC podría escalarse potencialmente hasta 2000 ml para la producción de ∼1 × 109 CM humanas en un solo lote, que se ha discutido como una dosis celular terapéutica apropiada para reemplazar la pérdida de CM inducidas por IM. Curiosamente, este rendimiento calculado refleja de cerca nuestros resultados anteriores logrados para la expansión de mESC y la diferenciación cardíaca que demuestra la producción de 1 – 5 × 109 CM, en biorreactores a escala de 2000 ml. Sin embargo, un trabajo reciente sobre la diferenciación cardíaca de hPSC en un reactor de tanque totalmente equipado mostró que las modificaciones del proceso, por ejemplo, mediante el control de OD, pueden aumentar sustancialmente el rendimiento de CM, lo que sugiere un gran potencial de optimización futura.

Tomados en conjunto, el estado actual en el campo del procesamiento de PSC sugiere que el cultivo en suspensión en biorreactores instrumentados tiene un gran potencial para el desarrollo de procesos a escala clínica e industrial, pero aún se requieren avances significativos y pasos de ampliación.

Más allá de modificar la densidad de inoculación, la velocidad de agitación y la concentración de oxígeno, hasta donde sabemos, todavía no se han publicado parámetros de proceso significativos, como el control del pH mediante ciclos de retroalimentación automatizados, para el procesamiento de hPSC.

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Optimización y limitaciones del procesamiento de hPSC en biorreactores agitados

Aplicando el enfoque de agregado sin matriz, recientemente se realizaron varias pruebas de optimización en el modo de alimentación por lotes (generalmente realizando un cambio de medio completo una vez al día), equivalente a la estrategia de alimentación típica en el cultivo 2D convencional. Se han publicaron investigaciones exhaustivas sobre la densidad de inoculación y la tasa de agitación en un diseño experimental factorial de dos parámetros y tres niveles, mientras que otros investigadores han probado por separado más parámetros, incluida la tensión de OD en bioreactores instrumentados de tanque agitado. Aunque se demostró una estrecha interdependencia de los parámetros individuales, el progreso general con respecto a la densidad de recolección de células máxima alcanzada fue limitado, lo que sugiere la presencia de condiciones de proceso subóptimas o perjudiciales.

Utilizando tres medios de cultivo de hPSC convencionales, el estudio sugiere que ni la glucosa ni las limitaciones de aminoácidos parecen limitar la proliferación de hPSC cuando se apunta a densidades celulares más altas en cultivo en suspensión, sino más bien la acumulación de subproductos metabólicos como amonio y / o lactato. Dado que las hPSC se basan principalmente en la glucólisis (es decir, en contraste con las células somáticas en las que el metabolismo está dominado por la fosforilación oxidativa) para cubrir su demanda de energía y bloques de construcción metabólicos, la acumulación sustancial de lactato y la acidificación del cultivo son las consecuencias esperadas del aumento de la densidad celular. Esto podría representar un obstáculo importante para lograr rendimientos de procesos específicos más altos, particularmente en el modo de alimentación por lotes, que se ha demostrado que da como resultado patrones de proceso marcados y oscilantes en el intercambio diario de medio en biorreactores instrumentados.

Para generar un entorno de cultivo más homogéneo y lograr una alta densidad celular, la alimentación por perfusión está bien establecida en la biotecnología a escala industrial. Los estudios iniciales sobre hPSC han demostrado de hecho que la alimentación por perfusión puede tener un impacto sustancial en la expansión y diferenciación de PSC en reactores instrumentados 2D y 3D. La perfusión se caracteriza por un intercambio continuo de medio en el recipiente de cultivo por medio fresco, que típicamente se basa en dispositivos de retención de células para evitar el lavado de células del biorreactor junto con el intercambio continuo de medio. La perfusión permite además una mejor automatización del proceso y un mejor control del entorno de cultivo, incluido el pH, la tensión de OD y la concentración de nutrientes y productos de desecho. Además, la capacidad de autoacondicionamiento de las células mediante la secreción de factores estimulantes de crecimiento, que podrían ser controlados por el caudal en perfusión, podría permitir reducir los costosos componentes del medio.

Recientemente, se demostró para las PSC de ratón que la perfusión puede mejorar el rendimiento del proceso y el rendimiento celular en reactores de tanque instrumentados que logran densidades celulares de> 2 × 107 ml-1 mediante el aumento de la tasa de perfusión hasta cinco veces los volúmenes de proceso / día, lo que refleja los resultados anteriores en 2000 ml en reactores instrumentados de nuestro grupo comparando alimentación por lotes y por perfusión. Sin embargo, todavía se dispone de estudios muy limitados sobre cultivos de perfusión de hPSC y no se conocen bien los mecanismos exactos por los cuales la perfusión mejora los rendimientos de PSC.

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Procesos de inoculación y estrategias de pasaje.

Debido a su sensibilidad a los pases basados en células individuales, lo que resulta en una pérdida celular esencialmente cuantitativa, las hPSC se pasaban tradicionalmente como colonias o grupos semidisociados en cultivo 2D y la inoculación de cultivos 3D inicialmente también se basó en esta estrategia. Dado que estos grupos de células tendían a adherirse entre sí dando como resultado una fusión extensa, particularmente en cultivos en suspensión estática, se ha sugerido la encapsulación en matrices para controlar este proceso. Las limitaciones de este enfoque incluyen la adición de matrices adicionales al proceso, el requisito de equipo especial y el control limitado sobre cuántas células o grupos quedarán atrapados en una sola cápsula. Otro problema es el estallido incontrolado de tales cápsulas, por ejemplo, en respuesta a la proliferación celular o al esfuerzo cortante en los biorreactores, lo que limita aún más el control y la reproducibilidad del método. Más recientemente, se informó que un polímero funcional denominado «goma de gelan» evita la fusión de los agregados en suspensión. Aunque el concepto subyacente es sólido, el método no admitía la siembra unicelular, sino que requería la interrupción mecánica de los agregados celulares mediante el procesamiento a través de un colador para la inoculación y el pase del proceso.

Por el contrario, el paso de células individuales permite, en principio, un proceso de inoculación completamente definido a una densidad celular preoptimizada. Por lo tanto, la estrategia apoya el control experimental en ciencia básica y facilita sustancialmente el desarrollo de procedimientos operativos estándar (POE) requeridos para los procesos que cumplen con las BPM. La otra ventaja de los pases basados en células individuales es la disociación completa de colonias (2D) y agregados (de 3D) en cada paso de expansión, lo que interrumpe la interacción intercelular prolongada en el núcleo de las respectivas colonias o agregados. La disociación completa interrumpe los contactos establecidos célula-célula, contrarrestando la formación de gradientes locales y el desarrollo de heterogeneidad de cultivo no deseada, lo que potencialmente desencadena una diferenciación incontrolada.

Sin embargo, el prerrequisito para el paso de hPSCs basado en células individuales era el desarrollo de medios de cultivo avanzados y particularmente la suplementación del compuesto químico Y-27632, un potente inhibidor de la quinasa asociado a Rho, que parece apoyar transitoriamente la vitalidad de hPSCs individuales, creando una ventana para la reagregación de hPSC después de la siembra.

Microportadores ocultivos de suspensión sin matriz: Pro y Contra

Una estrategia exitosa para la transición de hPSC a cultivo en suspensión es el uso de microportadores (MC). Se trata de partículas fabricadas a partir de diferentes materiales disponibles en diferentes formas y tamaños, que pueden utilizarse con nuestro sin recubrimiento de matriz adicional. Los MC se introdujeron en el bioprocesamiento para proporcionar células dependientes del anclaje, que son difíciles de adaptar al cultivo en suspensión, con una «superficie flotante» para la unión y, en paralelo, para elevar ampliamente el área de superficie tras la transición a 3D. La expansión de hPSCs sobre MC se ha demostrado con éxito en placas de cultivo estáticas seguidas de condiciones de agitación que incluyen matraces giratorios y biorreactores de tanque agitados instrumentados. A pesar de este éxito, los investigadores han observado la tendencia de las hPSC a adherirse entre sí (en lugar de a los tipos de microportadores preseleccionados), lo que induce un nivel adicional de heterogeneidad de cultivos. Los tipos de MC rígidos también podrían aumentar la tensión de cizallamiento, particularmente en condiciones de agitación, y se observó una fase de retraso extensa en la transición de hPSC a MC en biorreactores. El enfoque también requiere la eliminación potencialmente engorrosa de microportadores de preparaciones de células de grado clínico antes de las aplicaciones clínicas.

Utilizando el producto químico ROCKi en combinación con la disociación enzimática en células individuales para una inoculación más estandarizada, nosotros y otros hemos demostrado la expansión de hPSC indiferenciadas como agregados de células libres de matriz en suspensión estática y en matraces giratorios agitados. En estos estudios de prueba de concepto, se demostró el mantenimiento de la pluripotencia y la estabilidad del cariotipo en numerosos pasajes (es decir, ciclos repetidos de disociación y reagregación agregadas). Posteriormente, se llevó a cabo la transferencia a biorreactores instrumentados de tanque agitado a escala de 100 ml (sistema de reactor DASGIP paralelo, Julich, Alemania) incluyendo la optimización inicial de las densidades de inoculación celular y las condiciones de agitación (como el diseño del impulsor y la velocidad de agitación). Los parámetros clave del proceso, incluida la cinética de crecimiento, el pH, el OD y la concentración de lactato, se controlaron durante los 7 días de duración del proceso.

En comparación con el cultivo en suspensión en placas de plástico, donde las células están más concentradas en el fondo de la placa debido a la gravedad (en lugar de estar distribuidas homogéneamente en 3D completo), inoculadas a ~ 0.5-1 × 105 cellml − 1 aproximadamente cinco a Se requirió una siembra de células diez veces mayor a ~ 5 x 105 células ml-1 para la formación exitosa de agregados en reactores con agitación de impulsor. Posteriormente se consiguieron densidades de recogida de células de aproximadamente 2 x 106 células ml-1 correspondientes a una expansión de tres a seis veces por pase en condiciones de agitación. Por tanto, a pesar del éxito general del método, estos datos solicitan una optimización sustancial del proceso con respecto al rendimiento celular por mililitro de medio y también al rendimiento global del proceso.

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Ventajas del uso de biorreactores de tanque agitados instrumentados

Recientemente, el campo está llegando a un consenso de que el cultivo en suspensión 3D tiene un gran potencial para lograr los requisitos extensivos de número de células para la producción y diferenciación de hPSC mediante la optimización sistemática del proceso y el aumento de escala. En este sentido, los biorreactores de tanque agitado totalmente equipados proporcionan numerosas ventajas para el desarrollo de procesos eficientes de cultivo en suspensión, que son las siguientes:

  1. La agitación controlada por impulsor asegura una mezcla y distribución homogénea de células, nutrientes y gases en todo el cultivo.
  • El diseño del impulsor y la velocidad de agitación, además de la densidad de inoculación celular, permiten el control de la agregación celular y el desarrollo de agregados.
  • Los reactores de tanque completamente instrumentados (a diferencia de los matraces giratorios simples) permiten monitorear y, lo que es más importante, controlar y modular los parámetros clave del proceso, incluido el pH, el OD y el monitoreo potencialmente en línea de la biomasa viable. Herramientas de proceso adicionales, por ejemplo, para el monitoreo en línea de parámetros metabólicos, se establecen fácilmente para biorreactores más grandes. Actualmente, se están desarrollando herramientas avanzadas para evaluar y controlar mejor las características específicas de las células madre, como el monitoreo no invasivo sin etiquetas de la pluripotencia de las células frente a la diferenciación y la microscopía 3D automatizada de agregados de células suspendidas y es probable que se implementen en biorreactores agitados en un futuro próximo.
  • Los puertos respectivos permiten el muestreo simple y regular de células y medios para un análisis adicional fuera de línea.
  • Los puertos de entrada y salida en combinación con respecto a los sistemas de retención de células permiten un rendimiento medio constante, lo que permite estrategias de alimentación más flexibles y controladas. Esto permite, por ejemplo, aplicar la alimentación por perfusión, que tiene ventajas sustanciales en comparación con la alimentación por lotes típica mediante un solo bolo medio aplicado típicamente en cultivo de tejidos 2D y para reactores convencionales de matraz giratorio.
  • Los sistemas de biorreactores de tanque paralelos a pequeña escala que consisten en numerosos recipientes controlados y monitoreados de forma independiente apoyan el desarrollo del proceso multiparamétrico; la disponibilidad de sistemas de reactores más grandes físicamente equivalentes apoya posteriormente el aumento de escala del proceso lineal relativo.
  • Los recipientes de cultivo desechables que cumplen con las GMP y que están disponibles en la mayoría de las dimensiones del proceso permiten la traducción clínica.

Debido a estas ventajas, la tecnología de los reactores de tanque agitado se utiliza ampliamente en las industrias biotecnológicas para la optimización y posterior producción en masa de proteínas recombinantes y vacunas a partir de líneas celulares de mamíferos establecidas como células CHO, HeLa y HEK293, por lo que los procesos establecidos en> 1000 l Se han establecido reactores a escala. Sin embargo, los respectivos bioprocesos tienen como objetivo la producción de productos derivados de células, como proteínas o vacunas, únicamente, prestando una atención limitada a las características biomédicas de las células. Este enfoque está en marcado contraste con la producción prevista de células madre y sus progenies para las terapias celulares. Debido a las condiciones de cultivo relativamente complejas para las CEP (así como para otros tipos de células madre como las CMM y las células madre hematopoyéticas (CMH)) en el estado pluripotente y el régimen de diferenciación, a menudo aún más laborioso, necesario para la derivación de la mayoría de tipos de células específicas El procesamiento de PSC en reactores de tanque agitado está todavía en su infancia.

Debido a esta complejidad, las dimensiones del proceso actual se centran en ensayos de optimización de escala de 100 ml, como máximo. Los altos costos de los medios de diferenciación y cultivo específicos de células madre, que a menudo incluyen componentes sujetos a variación de lote a lote, como la albúmina de suero bovino (BSA) o humano (HSA), ralentizan aún más este campo de investigación.

Finalmente, la transición del cultivo de hPSC 2D establecido hacia la suspensión agitada ha sido un desafío debido a las características inherentes de las células, como se describe con más detalle en las siguientes secciones.

Las mESC, que se establecieron en 1981 y, por tanto, mucho antes que las hESC de 1998, así como las iPSC de ratón / humano en 2006/2007, se utilizaron inicialmente como modelo para el desarrollo del proceso de PSC. y ampliación.

Está bien establecido que las mESC se pueden cultivar como agregados celulares al menos para la inducción de la diferenciación, que luego se denominaron cuerpos embrioides (EB) debido a su potencial de diferenciación multilinaje. Los primeros trabajos mostraron que la inoculación de mESC como células individuales en cultivo en suspensión seguido de una condición dinámica (es decir, rotación o agitación) apoya la formación de EB más homogéneos en comparación con los controles estáticos, que inducen una fusión celular y agregada perjudicial. Estas observaciones condujeron primero a procesos para la expansión de masa combinada y la diferenciación de mESCs en biorreactores totalmente instrumentados y agitados en una escala de 2000 ml. Es importante destacar que este trabajo demostró que la agregación de mESC se puede controlar mediante las condiciones de agitación, es decir, la velocidad de agitación. Utilizando líneas de mESC diseñadas por ingeniería, estos estudios también demostraron la inducción de un rendimiento celular relativamente alto de ~ 1 × 107 mESC ml − 1 durante una fase combinada de expansión y diferenciación celular. 

Además, se demostró la producción exitosa de hasta ∼109 CM murinas en un solo ciclo de biorreactor a escala de 2000 ml, por lo que el enriquecimiento genético permitió> 99% de pureza de CM. Se logró una mayor optimización del proceso mediante la transición de la alimentación por lotes a la perfusión y dio como resultado un aumento de ~ cinco veces en el rendimiento de CM, lo que permitió cosechar hasta 4,6 × 109 CM en una sola corrida de biorreactor a escala de 2000 ml. Sin embargo, estos primeros experimentos con mESC se basaron en el uso de medios de cultivo complementados con suero de ternero fetal (FCS), rico en mitógenos y pobremente definido. También debe tenerse en cuenta que las mESC tienen una tasa de proliferación significativamente mayor, lo que corresponde a un tiempo de duplicación de la población (TFD) tres veces más corto de 12-16 h en comparación con ~ 36 h para las hESC. Además, a diferencia de sus homólogos humanos, las PSC de ratón también son menos sensibles con respecto a la viabilidad de las células después de la disociación, lo que favoreció la inoculación del proceso de cultivo mediante suspensiones de células individuales para el control posterior de la agregación celular en biorreactores agitados.

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