Biorreactores para la expansión de células madre pluripotentes

Requisito de las terapias celulares avanzadas para la reparación del corazón

Los trastornos cardiovasculares (ECV) representan las causas más importantes de muerte prematura en los países desarrollados. Estadísticas recientes demuestran que el 28% de las muertes prematuras en hombres y el 19% en mujeres menores de 75 años son el resultado de ECV. Las placas ateroscleróticas que restringen la luz y la flexibilidad de los vasos coronarios en el corazón a menudo preceden al infarto de miocardio (IM). La oclusión definitiva de un vaso puede desencadenar un IM al interrumpir el suministro de oxígeno y nutrición al área afectada. La isquemia tisular y la reperfusión subsiguiente pueden inducir la pérdida irreversible de miles de millones de cardiomiocitos (MC). Dado que los MC en el corazón humano maduro están detenidas en el ciclo celular, no muestran una proliferación prominente, si es que la hay. La evidencia reciente también ha desafiado la presencia de una población de células madre de potencial regenerativo relevante en el corazón. En consecuencia, en lugar de la regeneración de tejidos, se forma una cicatriz fibrótica acinética en el área afectada. Esta afección generalmente conduce a una función cardíaca reducida y, en última instancia, puede resultar en insuficiencia orgánica. La única opción curativa, el trasplante de corazón, está limitada por la falta de donantes de órganos. A pesar de los avances sustanciales en la ingeniería de los dispositivos de asistencia ventricular izquierda (DAVI), una máquina que conecta a los pacientes con insuficiencia cardíaca aguda con el trasplante de órganos, la técnica aún se ve obstaculizada por graves limitaciones. Estos incluyen infecciones frecuentes así como el alto riesgo de trombosis, que puede ocurrir a pesar de la necesidad de tomar fármacos diluyentes de la sangre que, por sí mismos, pueden provocar efectos secundarios indeseables como hemorragias incontroladas.

Por tanto, la terapia celular se ha concebido como una estrategia prometedora para la reparación del corazón. El objetivo es lograr la reparación tisular mediante la entrega ectópica de células al órgano, ya sea para estimular la regeneración endógena del corazón o para reemplazar directamente las MC perdidas por las células del donante trasplantadas. A pesar de los numerosos ensayos clínicos centrados en el trasplante de células propias del paciente derivadas, por ejemplo, de músculo esquelético, médula ósea o sangre periférica al corazón limitado, solo se logró la recuperación de la función cardíaca. Además, se ha negado la generación hipotética de MC por «transdiferenciación» de las células adultas (madre o progenitoras) de los pacientes después de un parto cardíaco. En la actualidad se acepta ampliamente que algunos subtipos específicos de células madre o progenitoras adultas, en particular las de la médula ósea, pueden estimular la recuperación del corazón mediante la liberación de factores paracrinos que desencadenan eventos moduladores de células y tejidos, como la disminución de las MC inducidas por MI, pérdida y / o revascularización tisular mejorada después de un IM. Sin embargo, queda por demostrar que estos efectos son lo suficientemente sustanciales como para mejorar significativamente la condición de los pacientes a largo plazo.

Estrategias basadas en células madre pluripotentes para la reparación del corazón

Un concepto alternativo apunta a reemplazar el tejido cardíaco dañado mediante el trasplante de MC genuinos generados in vitro, solos o en combinación con otros linajes. Los tipos de células que podrían fomentar la reparación del corazón cuando se cotransplantan con MC incluyen células endoteliales y pericitos para estimular la vascularización del injerto, fibroblasto formador de tejido conectivo y matriz extracelular, así como células madre mesenquimales (MSC), que han sido demostrado que actúa inmunomodulador y libera factores de pro-supervivencia, estimulando así el injerto de células del donante en el co-trasplante al corazón.

Todos estos tipos de células se han obtenido recientemente con eficiencias crecientes a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), como se ha demostrado para las células endoteliales, pericitos y CMM, así como CM bona fide. Además de su potencial para diferenciarse esencialmente en cualquier tipo de célula somática, las células madre pluripotentes (PSC) tienen la propiedad de proliferación ilimitada en el estado pluripotente, en condiciones de cultivo apropiadas. Mientras que las células madre embrionarias (ESC) han planteado preocupaciones éticas debido a su origen de embriones humanos en etapa de blastocisto, las hiPSC se derivan mediante la reprogramación de células somáticas. La tecnología iPSC no solo está superando problemas éticos, sino que también permite la derivación de PSC específicas del paciente, lo que, en principio, debería evitar el rechazo de las progenies derivadas de iPSC cuando se trasplantan al paciente de origen. Además, la tecnología abre la excitante posibilidad de establecer in vitro modelos de enfermedades específicas de pacientes y tejidos.

Con respecto al corazón, se han sugerido una gran cantidad de estrategias para la reparación de tejidos basada en hPSC, incluida la inyección transmural directa de CM derivadas de hPSC solas o en combinación con otras células y matrices, que se probó inicialmente en roedores modelos. Alternativamente, se considera el trasplante de láminas de células de múltiples capas o construcciones o parches de ingeniería de tejidos más sofisticados. Los obstáculos conocidos incluyen la escasa retención de células inyectadas en el tejido cardíaco, las bajas tasas de supervivencia in situ debido a condiciones hipóxicas, proapoptóticas, inflamatorias e inmunológicas, y la falta de estrategias sencillas para controlar y orquestar la , integración electromecánica de MC de donantes con células del músculo cardíaco endógenas. Recientemente, sin embargo, se demostró la formación exitosa de injertos sustanciales de CM derivadas de hESC en corazones infartados de primates no humanos. Además, utilizando enfoques de ingeniería de tejidos o agregados multicelulares, trabajos recientes también permitieron la implantación y seguimiento de derivados de hPSC en modelos porcinos de daño cardíaco. Además de los primates no humanos, los cerdos se encuentran entre los modelos más apropiados con respecto a la fisiología y fisiopatología del corazón humano, incluida una frecuencia de latido y un tamaño de órganos equivalentes. Si bien los roedores han sido muy útiles para demostrar la prueba de concepto para el acoplamiento funcional de CM derivadas de células madre embrionarias de ratón (mESC) a células endógenas del músculo cardíaco, los corazones de ratones y ratas se consideran de uso limitado para probar el acoplamiento electromecánico de CM derivadas de hPSC, ya que tienen una frecuencia de latido de cuatro a seis veces mayor en comparación con los humanos; Los conejillos de indias que tienen una frecuencia cardíaca de ~ 250 latidos por minuto (lpm) se han sugerido como una alternativa potencial, por lo que se encuentran en la interfase entre ratas (~ 400 lpm) y ratones (~ 600 lpm) en un extremo del espectro y cerdos, primates no humanos y el hombre (~ 60 – 200 lpm) en el otro extremo.

En particular, se publicó recientemente un primer estudio de caso de un paciente humano que recibió células progenitoras cardíacas derivadas de hESC, lo que demuestra que la tecnología está a la vanguardia de la traducción clínica. Esto resalta que, además de la producción de un gran número de células, se requiere urgentemente el procesamiento estandarizado de hPSC y sus progenies en condiciones que cumplan con las buenas prácticas de fabricación (GMP). Los respectivos procesos de producción de células serán obligatorios para facilitar el inicio de ensayos clínicos significativos destinados a probar la viabilidad y, lo que es más importante, la seguridad de las terapias celulares previstas. Sin embargo, para realizar pruebas funcionales preclínicas de CM derivadas de hPSC en modelos animales grandes se requiere fácilmente la producción robusta de miles de millones de células equivalentes a las dosis de células terapéuticas estimadas para el hombre, mucho antes de la aplicación clínica de rutina.

Posted in Biorreactores | Tagged , | Comentarios desactivados en Biorreactores para la expansión de células madre pluripotentes

Las células madre y su potencial

Las células madre caracterizadas por su potencial para crecer y diferenciarse en tipos celulares específicos in vitro podrían resolver el problema de la escasa disponibilidad de células en el desarrollo del hígado bioartificial. Además, el riesgo de reacciones inmunológicas en la terapia de trasplante celular se puede evitar si se utilizan células autólogas del paciente. Se están investigando diferentes tipos de células madre. De acuerdo con su potencial de diferenciación, se pueden dividir en células madre pluripotentes representadas por células madre embrionarias (ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), y células madre específicas de tejido (células madre «adultas») descritas en el hígado como células madre hepáticas, hepatocitos pequeños o células progenitoras. Los requisitos de la aplicación clínica específica deben tenerse en cuenta al elegir el tipo de célula madre que se utilizará. Una de las principales ventajas de las células madre «adultas» específicas de tejido sobre las células madre pluripotentes es su menor riesgo de desarrollos celulares no deseados, es decir, la formación de tumores y, en consecuencia, una mayor seguridad clínica, que facilita la traducción clínica de los resultados de la investigación in vitro.

Se han informado varios métodos para el aislamiento, cultivo y diferenciación de células madre hepáticas derivadas de hígado fetal o adulto. Los estudios in vitro sobre células madre hepáticas derivadas de tejidos mostraron que su comportamiento de cultivo está influenciado en gran medida por el suministro de citocinas, factores de crecimiento, hormonas y proteínas de la matriz extracelular. Los cultivos de células hepáticas humanas expuestos al plasma de pacientes con insuficiencia hepática aguda durante la terapia de soporte hepático clínico mostraron una mayor evidencia de activación del progenitor enfatizando la importancia de los factores regenerativos. Sin embargo, aún no se ha logrado la proliferación a gran escala de células progenitoras del hígado, lo que hasta la fecha restringe las aplicaciones clínicas de las células.

Debido a su mejor capacidad de crecimiento en comparación con los hepatocitos adultos, las células hepáticas fetales ofrecen la opción de ser utilizadas en sistemas de soporte hepático, pero también podrían expandirse en biorreactores para trasplante celular clínico. El trasplante intraesplénico de células hepáticas fetales en pacientes con enfermedad hepática crónica en etapa terminal fue bien tolerado y seguro, y mostró algunos efectos positivos en las puntuaciones clínicas. Los estudios en biorreactores de cuatro compartimentos perfundidos mostraron la idoneidad de los sistemas de cultivo 3D para apoyar el crecimiento y la maduración de las células fetales. Sin embargo, el uso de células fetales está restringido por preocupaciones éticas sobre el uso de tejido fetal.

Otro enfoque prometedor se basa en el uso de células progenitoras derivadas del páncreas de rata, que se diferencian en células hepáticas mediante la adición de dexametasona. Las células diferenciadas (células B-13 / H) mostraron una expresión estable de marcadores hepáticos, incluidas las actividades enzimáticas del citocromo P450 típicas del hígado, y mostraron un injerto específico del hígado en ratones. Por tanto, si el método se puede transferir con éxito a células humanas, pueden presentar una fuente fácilmente renovable y rentable de células funcionales similares a los hepatocitos.

Las células madre pluripotentes tienen la ventaja de una proliferación ilimitada in vitro y, por tanto, pueden usarse para generar grandes cantidades de células para una posible aplicación terapéutica. Los protocolos para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas en células hepáticas se basan principalmente en un procedimiento de dos pasos, utilizando varios cócteles de citocinas en programas de tiempo definidos para madurar las células primero en células endodérmicas, seguido de la maduración completa en células similares a los hepatocitos. Sin embargo, el uso de células madre embrionarias humanas está en debate debido a preocupaciones éticas sobre la generación de células a partir de blastocistos humanos.

Durante los últimos años, las células iPS humanas generadas mediante la reprogramación genética de células de tejido adulto han ganado una importancia cada vez mayor en la investigación con células madre. El uso de células iPS podría resolver el problema de la escasa disponibilidad de células para la regeneración de tejidos clínicos y el soporte de órganos. Un beneficio importante de las células es que se aceptan éticamente y se pueden generar principalmente a partir de las propias células del paciente para su uso en terapia autóloga. Así, las células iPS brindan la opción única para resolver los principales problemas de la medicina basada en células: la escasa disponibilidad de células adecuadas para la regeneración de órganos y el riesgo de reacciones inmunes en el caso de utilizar células xenogénicas. Dentro del alcance del desarrollo de nuevas terapias basadas en células de enfermedades hepáticas, las células derivadas de iPS corregidas genéticamente también podrían usarse para reparar enfermedades metabólicas genéticas, si se puede demostrar la seguridad de las células.

La disponibilidad de células derivadas de células iPS para uso clínico está actualmente limitada por los métodos existentes utilizados para expandir y diferenciar las células in vitro. Los protocolos actuales para la diferenciación hepática de células iPS se basan en la adición secuencial de diferentes combinaciones de factores de crecimiento y hormonas. Se intentó una maduración mejorada, por ejemplo, aplicando un protocolo basado en citocinas y moléculas pequeñas para la diferenciación directa de células madre embrionarias y células iPS en células hepáticas. Sin embargo, el rendimiento funcional de las células hepáticas derivadas de iPS sigue siendo insuficiente. Las investigaciones de la diferenciación espontánea de células ES de ratón o humanas en biorreactores perfundidos sugieren que se puede lograr una mejor diferenciación celular y formación de tejido en condiciones de biorreactor. Los estudios sobre la diferenciación hepática de células ES humanas indican que las técnicas de cultivo 3D también pueden ser adecuadas para promover la diferenciación específica del hígado de las células iPS.

En la misma línea de evidencia, se informó que el cocultivo de células iPS con células endoteliales y células madre mesenquimales en una matriz presolidificada resultó en la formación de estructuras 3D que mostraron altos niveles de funciones específicas del hígado después del trasplante en un modelo de ratón experimental.

La expansión de las células madre pluripotentes para la diferenciación está actualmente limitada por los métodos de trabajo intensivo para propagar las células en su estado indiferenciado. Además, el control de la proliferación celular y la dirección de la diferenciación celular para una aplicación clínica segura sigue siendo un desafío. Por lo tanto, se necesitan tecnologías de cultivo mejoradas para que las células estén disponibles para terapias de trasplante o soporte de órganos clínicos. En este contexto, el desarrollo de tecnologías específicas de biorreactores 3D parece ser importante también para el desarrollo de modelos de cultivo individuales para aplicaciones terapéuticas.

Posted in Biorreactores | Tagged | Comentarios desactivados en Las células madre y su potencial

Fuentes celulares para biorreactores hepáticos bioartificiales

biorreactores hepáticos

Un obstáculo importante para el uso clínico de los sistemas de biorreactores hepáticos bioartificiales es la falta de fuentes celulares eficientes y seguras para tales terapias. La fuente de células ideal sería de origen humano, mostraría todas las funciones típicas del hígado y sería expandible y libre de cualquier riesgo clínico para el paciente. En la última década, se han logrado avances significativos en las fuentes celulares de hepatocitos para el hígado bioartificial. Los enfoques incluyen células primarias, líneas de células hepáticas y células progenitoras o madre de diferentes orígenes.

Células primarias del hígado

Las células primarias de hígado porcino se han utilizado en varios dispositivos debido a su buena disponibilidad y funcionalidad in vitro. Se ha discutido un posible riesgo de transferencia de retrovirus endógeno porcino (PERV) durante la aplicación en pacientes, pero hasta la fecha no hay evidencia de infección por PERV en pacientes o de liberación de partículas infecciosas por células de hígado porcino cultivadas en hígados bioartificiales. Sin embargo, se necesita una vigilancia cuidadosa de los pacientes para detectar cualquier indicio de transmisión del virus. Además, el uso de tipos de células xenogénicas se asocia con un mayor riesgo de episodios de rechazo, y su desempeño metabólico muestra algunas diferencias con el metabolismo humano debido a diferencias entre especies.

Las células primarias de hígado humano representan la fuente celular de elección debido a su funcionalidad y seguridad clínica equivalentes en humanos. En un estudio piloto clínico realizado con el dispositivo MELS, se utilizaron células hepáticas humanas primarias de órganos de donantes descartados debido a una lesión orgánica (esteatosis, fibrosis / cirrosis, deficiencias vasculares), lo que demuestra la viabilidad de cultivar células hepáticas humanas primarias en sistemas de biorreactores específicos. Sin embargo, la escasa disponibilidad de hepatocitos humanos primarios en cantidad y calidad suficientes para la aplicación clínica restringe su uso en estudios clínicos. Además, la logística del aislamiento celular es extremadamente exigente. En el caso de utilizar células hepáticas primarias recién aisladas, se necesitan al menos 48 – 72 h desde la siembra celular hasta la aplicación terapéutica para permitir la recuperación celular del aislamiento y la adaptación al entorno de cultivo. En caso de insuficiencia hepática aguda, se debe proporcionar un soporte orgánico temporal de inmediato, lo que requiere la disponibilidad de sistemas a pedido que se pueden entregar listos para usar. Dado que la vida útil de las células primarias en los sistemas in vitro es limitada, los sistemas basados en células primarias deben estar constantemente disponibles y renovarse regularmente para estar preparados para uso clínico en caso de que un paciente necesite terapia. Por tanto, la posibilidad de almacenar los dispositivos de cultivo hasta su aplicación mejoraría enormemente la logística de las terapias hepáticas bioartificiales. La criopreservación de células podría resolver el problema del tiempo limitado de supervivencia de las células in vitro. Durante las últimas décadas se han investigado varios enfoques para la criopreservación de hepatocitos. Por ejemplo, los hepatocitos de rata encapsulados en microperlas de alginato al 2% y sometidos a un procedimiento complejo de congelación / descongelación mostraron funciones bien conservadas y se trasplantaron con éxito en un modelo experimental animal. En un enfoque similar, otros autores describieron un método para el almacenamiento de esferoides de células hepáticas encapsuladas en alginato a −80 ∘C o −170 ∘C durante un máximo de 1 año. Sin embargo, aún no se ha demostrado el aumento de los métodos de criopreservación para el número de células terapéuticas.

Como alternativa a las células primarias de hígado humano o porcino, se están investigando líneas de células hepáticas humanas para su uso en sistemas hepáticos bioartificiales debido a su considerable disponibilidad y viabilidad. La línea celular humana C3A, un derivado de la línea celular HepG2, se ha utilizado en ensayos clínicos con el sistema ELAD. Sin embargo, las células C3A muestran un nivel insuficiente de algunas funciones hepáticas importantes, incluida la desintoxicación del amoníaco y la síntesis de urea, y por lo tanto no son ideales para reemplazar las funciones del órgano nativo. La modificación genética de líneas celulares de hepatoma puede ser una forma de aumentar el rendimiento funcional de las células. Recientemente, se informó que la transfección de células HepG2 con aumentador de la regeneración hepática humana (hALR) conduce a un aumento de la producción de 𝛼-fetoproteína, urea y albúmina en comparación con las células HepG2 no transfectadas.

La línea celular HepaRG derivada del carcinoma hepatocelular humano representa una fuente celular prometedora para el desarrollo hepático bioartificial, ya que muestra una variedad de funciones específicas del hígado, incluido el metabolismo dependiente del citocromo P450. La línea celular tiene la capacidad de diferenciarse tanto en hepatocitos como en células biliares cuando se trata con dimetilsulfóxido. Las células HepaRG cultivadas en el biorreactor AMC mostraron un mayor rendimiento funcional en comparación con los cultivos en monocapa 2D en términos de eliminación de amoniaco, producción de urea y actividad del citocromo P450 3A4. 

El tratamiento de ratas con insuficiencia hepática inducida con células HepaRG cultivadas en AMC-BAL aumentó el tiempo de supervivencia de los animales en ~ 50% en comparación con el tratamiento con BAL libre de células. Además, en el AMC-BAL se demostró la secreción de ácidos biliares, incluida la hidroxilación, la conjugación y el transporte de sales biliares. El cultivo de HepaRG en biorreactores de fibra hueca de cuatro compartimentos mostró actividades metabólicas estables de varias enzimas del citocromo P450 relevantes para el ser humano durante hasta 4 semanas. Los estudios histológicos realizados en el sistema de biorreactor demostraron la presencia de estructuras biliares y similares a hepatocitos entre los capilares. Por tanto, las células HepaRG podrían ser de interés para los sistemas hepáticos bioartificiales para construir un sistema biliar para drenar la bilis producida por los hepatocitos.

Posted in Sin categoría | Comentarios desactivados en Fuentes celulares para biorreactores hepáticos bioartificiales

Biorreactores extracorpóreos y producción de células para trasplantes

Celular biorreactores

Si bien los sistemas de biorreactores extracorpóreos ofrecen una opción para el apoyo temporal del hígado defectuoso, se podrían usar métodos para la aplicación intracorpórea de células o tejidos diseñados in vitro para lograr la recuperación permanente del hígado enfermo. El trasplante de hepatocitos humanos primarios en el hígado o el bazo se ha investigado en varios estudios clínicos. Las terapias se realizaron para ayudar a los pacientes con insuficiencia hepática aguda a fulminante o para curar a los pacientes con trastornos metabólicos hereditarios, como hipercolesterolemia genética, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, defectos del ciclo de la urea o deficiencia del factor VII de la coagulación. Estos estudios demostraron la viabilidad técnica del trasplante de células y, en algunos casos, se observó alivio de los parámetros sanguíneos y / o mejoría clínica. Sin embargo, el bajo número de pacientes incluidos en esos estudios impide una evaluación definitiva de la eficacia de la terapia.

Los principales obstáculos para una aplicación más generalizada de este procedimiento son (i) la disponibilidad limitada de células hepáticas humanas primarias, (ii) el volumen limitado de células trasplantables que se puede aplicar sin riesgo de trombosis vascular y (iii) la necesidad de terapia inmunosupresora Aplicaciones de hepatocitos no autólogos. Para permitir aplicaciones clínicas seguras, las células generadas deben ser estables durante el mantenimiento in vitro y después del trasplante en el órgano objetivo, al menos hasta la auto-recuperación del tejido, o permanentemente si la auto-reparación no es posible.

Las técnicas de cultivo 2D estáticas utilizadas actualmente proporcionan un entorno poco fisiológico para las células cultivadas. Además, difícilmente es posible una mejora de los modelos de cultivo 2D para cantidades de células más grandes. Se supone que el cultivo celular en condiciones 3D se aproxima mejor al medio fisiológico que los cultivos 2D al mejorar los contactos físicos de célula a célula, la acumulación de matrices extracelulares y el suministro de factor de crecimiento local. En este contexto, las tecnologías de biorreactores y tanques de acero parecen importantes en términos de producción de células a gran escala en condiciones in vitro reproducibles y controlables. El desarrollo de la tecnología de biorreactores puede facilitar la expansión celular al proporcionar mejores condiciones para mejorar la entrega del factor de crecimiento y la estimulación paracrina del crecimiento celular.

Por ejemplo, se demostró la expansión exitosa de células madre embrionarias en sistemas de cultivo basados en microportadores. La importancia de la perfusión celular se demostró tanto en cultivos 2D como en unbiorreactor perfundidobasado en microportadores con control de oxígeno. Sin embargo, un nivel superior de cultivos de microportadores está limitado por la necesidad de pases frecuentes asociados con pérdidas celulares sustanciales. La generación de grandes cantidades de hepatocitos a partir de células madre embrionarias de ratón se investigó en un biorreactor rotatorio de microgravedad simulado provisto de hormonas y factores de crecimiento exógenos. Las células derivadas del cuerpo embrioide cultivadas en el biorreactor rotatorio exhibieron niveles más altos de genes y proteínas hepáticos que las células cultivadas en cultivo estático. Además, en un modelo de trasplante experimental se demostró un injerto exitoso en los hígados receptores de ratones desnudos.

El aumento de la expansión de células madre embrionarias de ratón en biorreactores de fibra hueca de cuatro compartimentos con un volumen de 8 ml u 800 ml dio como resultado la generación de un número de células de 5 × 109 células en un biorreactor de 800 ml, según lo determinado por los parámetros metabólicos y el ADN / cuantificación de proteínas. El análisis de la expresión del marcador confirmó la conservación de la pluripotencia en las células durante la expansión.Para que las células generadas in vitro estén disponibles para uso clínico en el trasplante de células, deben desarrollarse métodos para la diferenciación celular dirigida, así como tecnologías de recolección adecuadas que permitan la generación de células vitales y funcionales para tales aplicaciones. Una condición previa importante es la disponibilidad de una fuente de células adecuada para obtener células hepáticas que garanticen la seguridad clínica de las aplicaciones.

Posted in Biorreactores, tanques de acero inoxidable | Tagged , | Comentarios desactivados en Biorreactores extracorpóreos y producción de células para trasplantes

La necesidad de terapias hepáticas innovadoras.

La insuficiencia hepática como consecuencia de una enfermedad hepática crónica progresiva o aguda representa una situación potencialmente mortal que puede conducir a un coma hepático y finalmente a la muerte si no se trata adecuadamente. Las terapias convencionales disponibles, aunque a menudo son beneficiosas para el alivio de los síntomas clínicos, no son eficaces en el tratamiento causal de la enfermedad hepática aguda sobre crónica o aguda. Por tanto, hasta la fecha, la única terapia eficaz de la insuficiencia hepática terminal es el trasplante de hígado. La introducción del trasplante de hígado como opción terapéutica ha reducido significativamente la mortalidad de los pacientes con insuficiencia hepática aguda. Los avances logrados en las últimas décadas en técnicas quirúrgicas, cuidados intensivos, régimen inmunosupresor y métodos de conservación de órganos han hecho del trasplante de hígado una forma de terapia bien establecida y exitosa. 

Sin embargo, la escasez existente de órganos de donantes disponibles no permite una expansión significativa de los programas de trasplante, y el número de pacientes en lista de espera para trasplante supera ampliamente el número de órganos de donantes disponibles para trasplante. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar terapias alternativas o complementarias al trasplante de hígado. Se pueden concebir dos enfoques terapéuticos principales: soporte hepático temporal para unir la función del órgano hasta el trasplante o hasta la regeneración del propio hígado o curación permanente del órgano mediante trasplante de células para reparar el tejido dañado.

Requisitos de los sistemas de soporte hepático.

Para proporcionar un soporte temporal exitoso del órgano defectuoso en la enfermedad hepática en etapa terminal, se deben tener en cuenta las complejas funciones metabólicas de las células hepáticas. Las funciones principales del hígado son (i) transformación de metabolitos endógenos (p. Ej., Amoníaco) o componentes tóxicos exógenos (p. Ej., Fármacos, productos químicos) en metabolitos no tóxicos, (ii) regulación de moléculas pequeñas, en particular aminoácidos, carbohidratos y grasas ácidos, y (iii) la síntesis de proteínas como la albúmina o factores de coagulación que son liberados por el hígado a la sangre. Las alteraciones en una de varias de estas funciones pueden provocar acumulación de toxinas, desequilibrios en compuestos plasmáticos, por ejemplo, aminoácidos libres y / o hipoproteinemia, con consecuencias perjudiciales para el paciente. Por lo tanto, un sistema de soporte hepático ideal cumpliría todas las tareas principales del hígado humano en términos de desintoxicación, regulación y síntesis hepática.

Además de la funcionalidad y eficacia de los sistemas de soporte hepático, deben tenerse en cuenta cuestiones de seguridad. En particular, los sistemas utilizados para apoyar la función hepática en el hígado enfermo deben ser estables durante el período de tratamiento y mostrar funciones reproducibles para garantizar una calidad estandarizada. Además, se exige la investigación de la biocompatibilidad de los materiales utilizados y la prevención de la infección de los pacientes para garantizar la seguridad clínica de los tratamientos.

Sistemas de soporte hepático artificial

Los sistemas de soporte hepático artificial están destinados a eliminar las toxinas de la sangre de los pacientes con insuficiencia hepática mediante técnicas de adsorción mecánicas y / o químicas. Para proporcionar una desintoxicación eficaz, la mayoría de estos sistemas se basan en la desintoxicación del plasma del paciente con adsorbentes, tipo diálisis, utilizando carbón activado suspendido en el dializado para la adsorción de toxinas, o albúmina proporcionada en el líquido de diálisis como eliminador fisiológico de compuestos lipofílicos. El sistema de recirculación de adsorbente molecular combina la diálisis de albúmina con una columna de intercambio aniónico y de carbón, que permite el reciclaje de las moléculas de albúmina después de pasar por la columna de adsorbente. Se demostró que el sistema proporciona una eliminación eficaz de las toxinas plasmáticas del plasma en estudios preclínicos y clínicos. Se persigue un enfoque diferente en el dispositivo de desintoxicación de separación y adsorción de plasma fraccionado (FPSA), también conocido como sistema Prometheus, que conduce directamente el plasma a través de columnas adsorbentes sólidas para facilitar la eliminación de toxinas.

Se han publicado los resultados de varios ensayos clínicos aleatorizados de sistemas de apoyo artificial. El efecto sobre la insuficiencia hepática aguda de la diálisis con albúmina se investigó en un ensayo que incluyó a 49 pacientes tratados convencionalmente y 39 con terapia de diálisis con albúmina. Aunque se observó una tendencia hacia tasas de supervivencia más altas, no fue posible sacar conclusiones definitivas sobre la eficacia o seguridad del sistema. Estos resultados sugieren que la desintoxicación físico-química del plasma por sí sola no es suficiente para abordar la función hepática de manera que aumente la probabilidad de supervivencia. La cuestión de si la calidad de vida de los pacientes con enfermedad hepática aguda o aguda sobre crónica puede mejorarse mediante sistemas de soporte hepático artificial sigue abierta.

Posted in Sin categoría | Comentarios desactivados en La necesidad de terapias hepáticas innovadoras.

Biorreactores de tanque de acero inoxidable

Con la necesidad de desarrollar procesos que cumplan con las normativas, es cada vez más claro dentro de la industria de la terapia celular que los biorreactores agitados de tanques de acero inoxidable tradicionales se están pasando por alto en favor de los biorreactores de tanque agitado (SUB) de un solo uso, un tendencia alineada con la producción biofarmacéutica tradicional. Este interruptor alivia la carga reglamentaria de tener que validar los procedimientos de limpieza y esterilización y evita los grandes costos de capital e infraestructura asociados con los biorreactores de tanque agitado de acero inoxidable y su mantenimiento. También simplifica el proceso al reducir el tiempo y el costo asociados con los procedimientos de instalación y eliminación de desechos. Sin embargo, este enfoque tiene sus inconvenientes con respecto a los costos continuos de los SUB y, quizás lo que es más preocupante, la dependencia de un solo proveedor para un aspecto clave del proceso. Esta limitación tiene implicaciones con respecto tanto a la fiabilidad del suministro como a la calidad de los SUB. Cualquier problema que encuentre el proveedor con respecto al suministro de SUB, por defecto, se convierte en un problema para la empresa de terapia celular. De manera similar, será necesario una supervisión y validación estrictas para garantizar que la calidad dispositivos suministrados sea constante, ya que cualquier variación en la calidad de construcción puede tener un impacto directo en el proceso de terapia celular. Otro problema podría ser la capacidad de utilizar el protocolo de recolección descrito anteriormente en algunos SUB porque muchas de las configuraciones actualmente disponibles no podrían dar la breve ráfaga de agitación intensa requerida para separar las células. También será importante demostrar que son capaces de suspender eficazmente los microportadores con una agitación baja adecuada deseada para aumentar la densidad celular.

En la actualidad, el número de células producidas en microportadores en un biorreactor agitado en comparación con las obtenidas en la confluencia en un matraz en T sugiere que se ha logrado la confluencia en los microportadores. La densidad de siembra actual y la concentración de microportadores se basan en las condiciones de los matraces en T y en algunos estudios destinados a optimizarlas. Claramente, para obtener un mayor número de células, una mayor concentración de microportadores ayudaría, y se están realizando estudios en los que se agregan más nuevos durante el cultivo y luego se confía en la transferencia de perlas para poblarlos. Hasta la fecha, está resultando un problema no trivial. Además, a las densidades y escalas celulares actuales, se puede lograr una transferencia de oxígeno suficiente a través de la superficie superior del medio sin burbujeo.

A una cierta densidad y escala celular, probablemente se requerirá una mayor agitación y / o aireación burbujeante para satisfacer la demanda de oxígeno, nuevamente con todos los problemas de sensibilidad del cultivo celular (densidad celular y CDQ en este caso) a las tensiones dinámicas de fluidos, especialmente porque el burbujeo es potencialmente más dañino y el uso del surfactante protector.

Además del cambio hacia los SUB, también se ha centrado en el desarrollo de procesos de cultivo libres de suero y xenón. Una vez más, la razón principal que se cita a menudo para esto es el cumplimiento normativo y la necesidad de eliminar todos los componentes que contienen animales del proceso por razones de seguridad. Sin embargo, además de esto, también existen preocupaciones acerca de la variabilidad de un lote a otro asociada con el suero, que puede tener implicaciones significativas en el proceso, así como en la disponibilidad de suero y problemas de suministro. Como tal, ha habido una tendencia a reducir o eliminar el suero del proceso e incluso a desarrollar procesos completamente libres de suero y xenón.

La capacidad de realizar trabajos de desarrollo a pequeña escala permite que se lleve a cabo la optimización del proceso sin la necesidad de utilizar grandes volúmenes de reactivos o medios costosos. Hasta hace poco, la mayor parte del trabajo de desarrollo a pequeña escala, tanto para la producción biofarmacéutica tradicional como para la fabricación de terapias celulares, se realizaba en biorreactores más pequeños o matraces giratorios (generalmente 100 ml). Más recientemente, sin embargo, ha habido una afluencia de tecnologías de microbiorreactores que permiten estudios de alto rendimiento utilizando volúmenes de mililitros. Un ejemplo clave de esto es el biorreactor de microescala avanzado, que es un sistema de biorreactor automatizado de alto rendimiento que comprende hasta 48 recipientes de biorreactor de tanque agitado de 15 ml controlables individualmente con la capacidad de monitorear y controlar el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto. Sus características físicas se han definido recientemente, y ha demostrado ser un éxito para la investigación y el desarrollo biofarmacéuticos, y el trabajo realizado por varias empresas muestra que proporciona un rendimiento de proceso similar al de los sistemas de biorreactores de tanque de acero inoxidable a gran escala. 

Posted in Sin categoría | Comentarios desactivados en Biorreactores de tanque de acero inoxidable

Configuración de biorreactores para densidades celulares.

En un intento por aumentar las densidades celulares, la investigación se ha centrado en trabajar hacia las condiciones óptimas de bioproceso para el cultivo de microportadores de hMSC, como el tipo y la concentración de microportadores, oxígeno disuelto, densidad de siembra celular, composición del medio (incluido el suero y libre de xeno), medio régimen de intercambio, configuración del biorreactor y estrategia de agitación, entre otros. Vale la pena señalar que, aunque estos estudios han dado como resultado un progreso significativo hacia el desarrollo de un sistema de expansión de microportadoras escalable-hMSC, todavía hay margen de mejora, particularmente dado que muchos de estos estudios solo han considerado un factor a la vez y no han considerado un enfoque multifactorial y el efecto potencial de cada parámetro sobre otros.

Del mismo modo, se han realizado numerosos estudios para investigar la capacidad de cultivar células madre pluripotentes humanas (ya sea hESC o hiPSC) en microportadores en sistemas y configuración de biorreactores de tanque agitado, y algunos estudios se centran en las células que retienen su capacidad de pluripotencia, mientras que otros buscan generar una población de células especializadas. Con las células madre pluripotentes generalmente reconocidas como un tipo de célula más difícil de cultivar incluso en sistemas de monocapa en comparación con otros candidatos a terapia celular (por ejemplo, hMSC y HSC), es alentador que las células hayan podido crecer en microportadores en condiciones de tanque agitado. Sin embargo, algunos autores señalaron que las hESC pueden inducir la diferenciación en cultivos con microportadores, lo que puede ser el resultado de las fuerzas hidrodinámicas que experimentan las células en un entorno de cultivo agitado. Sin embargo, otros estudios con células madre pluripotentes humanas no han informado de diferenciación espontánea; como tal, será necesaria una mayor investigación para identificar el verdadero efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células.

Al igual que con la industria biofarmacéutica, se han planteado preocupaciones sobre el efecto de estas fuerzas hidrodinámicas, en particular, los esfuerzos cortantes experimentados por las células durante el proceso de expansión. Existe la percepción de que las células de mamíferos en general son «sensibles al cizallamiento» debido a su falta de pared celular, se sugiere en algunos textos que esta percepción afectó adversamente el desarrollo del cultivo de células de mamíferos en suspensión libre. La preocupación por la sensibilidad al cizallamiento era excesiva, y la mayoría de los procesos industriales que utilizan células de mamíferos ahora emplean en la configuración de biorreactores de tanque agitado.

Esta cuestión de la sensibilidad al cizallamiento también es una preocupación dentro de la industria de la terapia celular y se cita a menudo como una desventaja cuando se utiliza un sistema de biorreactor de tanque agitado. Obviamente, como se mencionó anteriormente, dada la necesidad de retener los CQA de las células y no solo la viabilidad, se debe tener especial cuidado al considerar el efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células madre cultivadas en biorreactores.

El enfoque actual en la configuración de biorreactores para comprender el daño tanto a las células suspendidas libremente como a las células en microportadores se basa en una comparación del tamaño de la entidad suspendida con la microescala de turbulencia de Kolmogorov (donde la microescala de turbulencia de Kolmogorov es una estimación del tamaño de los remolinos más pequeños con precisión de orden de magnitud y es una relación entre la tasa de disipación de energía específica local y la viscosidad cinemática). Si el tamaño de la entidad es lo suficientemente pequeño en comparación con la escala de Kolmogorov, entonces no debería ocurrir daño a la célula. Para el crecimiento, la escala de Kolmogorov no debe ser menor de ∼1 / 2 a 2/3 del tamaño del microvehículo. Dado que la microescala se reduce aumentando la intensidad de la agitación, para asegurar que la microescala no sea demasiado pequeña, se ha encontrado que es mejor operar el biorreactor a la velocidad mínima requerida para suspender simplemente los dispositivos. En estas condiciones, se ha demostrado que las células mantienen su CQA durante el cultivo.

Gran parte de la investigación sobre el cultivo de células madre se ha centrado principalmente en el aspecto de expansión del proceso. Sin embargo, igualmente importante es la capacidad de recolectar las células de manera eficaz, que esencialmente requiere un enfoque de dos pasos que implica primero el desprendimiento de las células de la superficie del biorreactor y luego la separación de la suspensión celular.  Gran parte del trabajo anterior solo había recolectado muestras de mililitros para estudios de análisis y caracterización celular, y como tal, aún estaba por probarse que se podría emplear una técnica escalable para recolectar con éxito las células. En resumen, basándose en conceptos teóricos subyacentes de configuración de biorreactores desarrollados para la nucleación secundaria debido a la agitación, se puede demostrar que los aumentos en la velocidad del agitador aumentan en gran medida las tensiones que separan las células. Esto conduce a su rápido desprendimiento (en aproximadamente 7 minutos) pero una vez desprendidos, las células son significativamente más pequeñas que la escala de Kolmogorov. Por lo tanto, la recolección implicó aumentar cinco veces la velocidad de agitación en comparación con la utilizada durante el cultivo en presencia de un reactivo de disociación para eliminar las células de la superficie y, posteriormente, una etapa de filtración para separar la suspensión unicelular de la suspensión del microvehículo. Se obtuvo una eficiencia de recolección de> 95% utilizando este método y, a pesar del aumento de cinco veces en la velocidad de agitación, las células recolectadas fueron viables y conservaron los atributos de calidad clave que describen el potencial de recolectar células en cantidad y calidad suficientes. Esta técnica se ha utilizado para recolectar tres líneas celulares de donantes diferentes utilizando dos microportadores diferentes en cada caso, manteniendo las células sus CQA. Dadas las teorías subyacentes involucradas en este enfoque, el protocolo también es esencialmente escalable.

Posted in Biorreactores, microbiorreactores | Tagged , | Comentarios desactivados en Configuración de biorreactores para densidades celulares.

Microportadores y biorreactores de tanque de acero agitado

biorreactores tanque de acero
biorreactores tanque de acero

La investigación en microportadores y biorreactores de tanque de acero agitado para aplicaciones de terapia celular ha aumentado rápidamente desde mediados de la década de 2000.

Esto se debe principalmente a la constatación de que es poco probable que otras plataformas de fabricación de terapias celulares puedan generar la cantidad de células para indicaciones clínicas, que requieren > 109células por lote.

Se han realizado numerosos estudios utilizando biorreactores de tanque de acero agitado y microportadores tanto en el ámbito académico como en la industria, y aunque la escalabilidad ha sido el factor principal para cambiar a un sistema de biorreactor de tanque agitado, existen otras ventajas.

Estos incluyen la capacidad de monitorear y controlar los parámetros clave del bioproceso, la flexibilidad para operar a través de diferentes modos de operación (es decir, lote, lote alimentado, perfusión) bajo un sistema completamente cerrado y la capacidad de lograr un sistema bien mezclado, creando así un ambiente de cultivo homogéneo.

Además, hemos demostrado que también ofrecen la posibilidad de recolectar células in situ.

No se requirieren generalmente adaptaciones específicas para hacer crecer con éxito las hMSC en el biorreactor de tanque agitado.

Algunos sistemas constan de cuatro deflectores unidos perpendicularmente a la pared del recipiente con un impulsor de tres palas de paso de 45que bombeaba hacia abajo, que se agita a la velocidad mínima requerida para mantener los microportadores en suspensión.

Vale la pena señalar que esta dirección de bombeo, combinada con un diámetro del impulsor (D) de ~ 0,4 del diámetro del tanque del biorreactor (T) (aquí D / T = 0,44) permite la suspensión de microportadores con la menor intensidad de agitación.

Los biorreactores de tanque agitado utilizados junto con microportadores tienen la ventaja de que son sistemas bien entendidos y bien caracterizados, que demuestran ser rentables y fiables para la producción biofarmacéutica.

Además de esto, con la necesidad de ser lo suficientemente personalizables para acomodar múltiples células candidatas a terapias, los sistemas de microportadores son ventajosos porque los microportadores específicos están actualmente disponibles o se pueden desarrollar con carga variable, revestimiento de superficie y forma para adaptarse a tipos de células específicos.

Además, con respecto a la personalización y la flexibilidad, los biorreactores de tanque agitado permiten diferentes modos de operación, como cultivo por lotes, lote de alimentación o cultivo de perfusión, que nuevamente se pueden adaptar para cada proceso dependiendo de los requisitos específicos de la célula.

Descripción general de los estudios que utilizan un biorreactor de tanque de acero agitado y un sistema de microportador

Los estudios han investigado el cultivo de múltiples tipos de células en microportadores, incluidas las ESC de humanos y ratones, las hiPSC y las hMSC. Sin embargo, la mayor parte de la literatura sobre la expansión de microportadores de células madre se ha realizado en hMSC, con una variedad de microportadores disponibles comercialmente.

Aunque originalmente gran parte de la investigación sobre MSC y expansión de microportadores se centró en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en 2007, Frauenschuh et al. publicó el primer estudio de expansión de MSC en microportadores con el único objetivo de la producción de células.

Muchos de los estudios realizados hasta ahora han demostrado la capacidad de cultivar hMSC en microportadores, algunos incluso a escala de litros, y a lo largo de los años, ha habido un aumento constante en las densidades celulares notificadas que se pueden obtener a través de estos sistemas. Incluso con la densidad celular actual, demostramos que un biorreactor de 5 l que contiene 2,5 l de medio de cultivo puede producir tantas células como ~ 65 matraces T-175 totalmente confluentes que se cultivan en un sistema de escalamiento controlado, equivalente a ~ 2/3 de la capacidad de CompacT SelecT.

Posted in Biorreactores, tanques de acero inoxidable | Tagged , | Comentarios desactivados en Microportadores y biorreactores de tanque de acero agitado

Tecnología celular a escala en biorreactores.

Biorreactores celulares

La tecnología celular a escala en biorreactores es la ampliación de una terapia celular alogénica a granel que proporciona un modelo de negocio atractivo, con grandes lotes de productos fabricados en biorreactores utilizando un proceso similar a los adoptados por los fabricantes actuales de biofármacos que utilizan cultivo celular en suspensión libre.

Hay varios tipos de fermentadores disponibles, cada uno con diferentes ventajas y desventajas. Estos diferentes tipos se describen a continuación.

Los biorreactores de movimiento oscilante se utilizan como tecnología no invasiva y de un solo uso para el cultivo de células en suspensión.

La mezcla se logra mediante el movimiento de balanceo y, por lo tanto, no requiere partes móviles internas, lo que lo hace muy apto para la fabricación desechable.

El control se logra mediante el monitoreo no invasivo de los parámetros del proceso, como la temperatura y la concentración de oxígeno disuelto (dO2) (generalmente expresado como% con respecto a la saturación con aire (100%)), en un proceso funcionalmente cerrado, que se utiliza para aplicaciones GMP.

Los tipos de células dependientes del anclaje se pueden cultivar en microportadores en suspensión, aunque existen algunos problemas asociados con los microportadores que se quedan varados en la base durante el ciclo de balanceo, además, debido a la suave mezcla del balanceo, la recolección de células de la superficie del microportador puede tener que tenga lugar en un recipiente biorreactor.

Se han desarrollado biorreactores accionados neumáticamente para el cultivo celular en suspensión libre para proporcionar un entorno de mezcla llamado de «bajo cizallamiento», impulsado por burbujeo de aire en un impulsor vertical con base de rueda.

El movimiento de la rueda mezcla el contenido del biorreactor y ayuda a la transferencia de oxígeno y CO2permitiendo el muestreo y control del proceso.

El movimiento también es capaz de suspender microportadores, que proporcionan una superficie para que las células crezcan.

El burbujeo necesario para impulsar el mezclador es una consideración importante para el diseño y funcionamiento de biorreactores, ya que se sabe que las burbujas que estallan son perjudiciales para la viabilidad celular.

Teniendo en cuenta que el burbujeo de gas es fundamental para el funcionamiento de biorreactores de accionamiento neumático, estas implicaciones deben considerarse cuidadosamente.

Debido al impulsor vertical, el funcionamiento de estos biorreactores a volúmenes reducidos puede verse algo afectado, lo que también podría afectar la operatividad.

Un ejemplo de esto es el paso de recolección de células, que típicamente requiere una reducción de volumen in situ antes del desprendimiento de células, como se explica más adelante.

Combinado con la baja entrada de energía de la rueda que gira lentamente, este requisito podría dificultar el desprendimiento y la recolección de productos de terapia celular en biorreactores de accionamiento neumático.

Se han empleado lechos empaquetados y fluidizados para la producción de terapia celular debido a las altas densidades celulares que se pueden lograr durante la expansión.

En estos sistemas, las células adherentes se cultivan en material de empaque, mientras que el medio de cultivo se perfunde a través del biorreactor, para alcanzar densidades de células cercanas a 108células ml − 1.

La perfusión del medio de cultivo permite el seguimiento y control de las condiciones del proceso, que, como se mencionó anteriormente, es de importancia crítica en el desarrollo de un proceso de fabricación reproducible.

A pesar de las ventajas de las densidades celulares elevadas, esta estructura introduce un riesgo de ensuciamiento y la formación de gradientes de concentración axiales y radiales, especialmente a gran escala.

Además, la recolección de células de estos sistemas puede ser problemática debido a las altas densidades celulares presentes y la dificultad de introducir los fluidos de desprendimiento de manera efectiva en los lechos.

La recolección es una consideración clave que necesita tanta consideración como el cultivo celular, ya que la calidad celular debe mantenerse durante todo el proceso de expansión y recolección.

Estos sistemas se están desarrollando actualmente junto con programas clínicos, con ensayos clínicos que utilizan células placentarias expandidas para el tratamiento de la enfermedad arterial periférica, la hipertensión pulmonar y la lesión muscular.

Los biorreactores de tanque agitado son, con mucho, la plataforma más común utilizada para el cultivo de células de mamíferos, ya sea en suspensión libre o en microportadores basados en los bioprocesos actuales.

Existen convenios bien establecidos para la ampliación del funcionamiento.

Muchas empresas están aplicando este conocimiento actual al desarrollo de productos de terapia celular, utilizan habitualmente biorreactores a 50 litros.

Estos sistemas proporcionan un entorno homogeneizado para el cultivo celular, con tecnología existente disponible para el seguimiento y control de procesos.

El cultivo de células madre en tanques agitados se ha demostrado en suspensión para ESC, iPSC, MSC y HSC.

La expansión y recolección de células adherentes también se ha demostrado para la producción de MSC en biorreactores de tanque agitado, aunque las densidades celulares logradas hasta la fecha son relativamente bajas.

Sin embargo, las densidades celulares en los biorreactores agitados aumentan constantemente y probablemente experimentarán mejoras similares en el rendimiento del producto a las que se han experimentado en los bioprocesos tradicionales de cultivo celular.

Teniendo en cuenta los sólidos datos heredados que existen y las décadas de experiencia que respaldan su operación a gran escala, es probable que se produzcan varias terapias celulares alogénicas a granel en biorreactores de tanque agitado.

Posted in Biorreactores, Ingeniería | Tagged , | Comentarios desactivados en Tecnología celular a escala en biorreactores.

Escalamiento horizontal Biorreactores

fermentadores-matraces
biorreactores giratorios

El escalamiento horizontal Biorreactores es importante ya que el cultivo de células adherentes se ha realizado tradicionalmente en matraces de cultivo de tejidos, que se cultivan en incubadoras en condiciones estáticas.

Luego, la producción se puede escalar aumentando el número de matraces, con el doble de células que requieren el doble de matraces en los biorreactores.

Para una terapia autóloga, este enfoque requiere mucho espacio de sala limpia, ya que cada lote de pacientes debe estar separado y la fabricación se vuelve costosa para un gran número de pacientes.

Este método de escalado de matraces de cultivo de tejidos requiere mucha mano de obra y, debido a las condiciones estáticas, no es posible el muestreo y el control.

Algunas de estas limitaciones pueden resolverse automatizando el cultivo de matraces y ahora existen varias plataformas robóticas.

Estas plataformas son capaces de manipular hasta 100 matraces con una superficie combinada de 17 500 cm2 y se ha demostrado que reducen la variabilidad en el proceso.

El tiempo de agrupación requerido durante un proceso de fabricación a escala horizontal tiene el potencial de afectar negativamente las características del producto y, por lo tanto, limitará la escala de estas técnicas.

Ha habido un impulso para aumentar el área de superficie contenida en los frascos de cultivo de tejidos, y algunas empresas han desarrollado sistemas con múltiples capas que ofrecen hasta 25 440 cm2 de área de superficie por frasco.

Una de las preocupaciones con el uso de matraces multicapa o pilas de celdas es el desarrollo de un entorno heterogéneo dentro del sistema debido a problemas con la transferencia de masa y calor.

Por lo tanto, también se han realizado esfuerzos para producir tecnología de capas múltiples cerradas con medio perfundido de modo que los parámetros del proceso se puedan monitorear y controlar durante el cultivo.

Biorreactores y matraces giratorios.

Los matraces rotativos, comúnmente denominados botellas rotativas, se han utilizado ampliamente en el bioprocesamiento tradicional para la producción de vacunas y proteínas a partir de tipos de células adherentes.

Estos sistemas utilizan toda la superficie interna del matraz y requieren un volumen mucho menor de medio de cultivo por superficie en comparación con los matraces de cultivo estáticos.

La rotación también proporciona un nivel de mezcla, lo que mejora el intercambio gaseoso y el control de la temperatura y permite el muestreo y el monitoreo del medio de cultivo.

Al igual que con los matraces estáticos, los matraces rotativos requieren mucha mano de obra y también incurren en la penalización de tiempos de agrupación elevados, lo que puede limitar la escala potencial del proceso de fabricación.

Una limitación adicional de un proceso de botella giratoria para la fabricación de terapia celular es la limitación en el control de la composición de O2 y CO2 tanto en la fase gaseosa como en la líquida del cultivo.

Tradicionalmente, los operadores han cultivado y manipulado los recipientes giratorios en grandes almacenes con temperatura controlada y, por lo tanto, no será posible su funcionamiento a concentraciones de O2 inferiores a la atmosférica, que se utiliza comúnmente para el cultivo de terapia celular.

Dispositivos de fibra hueca

Los biorreactores de fibra hueca se pueden utilizar para proporcionar áreas de gran superficie para la expansión celular.

sistema funcionalmente cerrado proporciona 21 000 cm2 por biorreactor, cumple con las normas GMP y un solo operador puede operar y recolectar varias unidades.

El medio se perfunde a través de las fibras, lo que significa que se puede realizar un seguimiento y control automatizados de las concentraciones de metabolitos, lo cual es importante para mantener la consistencia del proceso.

Debido a la naturaleza del sistema de fibras huecas, existe la posibilidad de que se formen gradientes de concentración longitudinales a medida que el medio de cultivo o el reactivo de disociación fluyen por las fibras.

Además, la expansión a gran escala utilizando múltiples unidades de fibra hueca requiere pasos de crioconservación entre procesos, ya que el número de unidades requeridas aumenta exponencialmente y rápidamente se convertiría en un costo prohibitivo.

Posted in Biorreactores, fermentadores | Tagged , | Comentarios desactivados en Escalamiento horizontal Biorreactores