- Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores
- Evaluación del Diseño Experimental en biorreactores.
- Diseño de experimentos de cribado en biorreactores
- Diseño de experimentos de biorreactores para el desarrollo y optimización de medios .
- Cromatografía líquida de alta resolución en línea
Interacciones con la centrifugación y con los pasos de filtración
La centrifugación es un paso de cosecha crítico en la industria biotecnológica, particularmente a escala de fabricación.
King et al. contribuyeron con una evaluación importante de la importancia de los parámetros operativos para el procesamiento de interacciones con la centrifugación típico, quienes llevaron a cabo un análisis de sensibilidad global (GSA) de la centrifugación de caldos de células de levadura de mamíferos y de alta densidad.
Demostraron que el análisis global mostró diferencias importantes, debido a las interacciones, que los cálculos de sensibilidad de un solo parámetro más tradicionales.
También demostraron que el tamaño crítico de las partículas era el parámetro más importante en el procesamiento del caldo de células de mamíferos y que la velocidad de flujo era el parámetro más importante en el procesamiento del caldo de células de levadura. Naturalmente, tales conclusiones se limitan a los rangos en los que se realizó el GSA.
Dichos resultados son importantes para evaluar el efecto combinado del biorreactor y la centrífuga: el caudal operativo de la centrífuga y su rendimiento (normalmente el nivel de clarificación) deben elegirse en función de la dependencia interactiva de los parámetros relevantes del caldo celular.
Li et al. presentó un ejemplo instructivo del impacto acumulativo de la fermentación y la homogeneización en las interacciones con la centrifugación en un formato ultra reducido.
Se sabe que las condiciones de fermentación afectan la homogeneización, por ejemplo, las células recolectadas en la fase exponencial son más fáciles de homogeneizar que las células recolectadas en la fase estacionaria.
La homogeneización, a su vez, afecta a las interacciones con la centrifugación, así como a los pasos posteriores, como la cromatografía. Por lo tanto, es extremadamente importante imitar cuantitativamente el proceso a escala de banco o de fabricación en el formato USD.
Li et al. pudieron demostrar que los parámetros críticos se conservaron cuantitativamente al usar acústica enfocada para reemplazar la homogeneización.
Una variedad de pasos de filtración de flujo tangencial y sin salida se encuentran comúnmente en las secuencias de bioprocesos en la actualidad; Reis y Zydney brindan un resumen útil.
Crucell (ahora una subsidiaria de Johnson & Johnson) presentó un enfoque interesante para la separación celular a densidades extremadamente altas (aproximadamente 120 millones de células PER.C6 por ml).
La filtración profunda en biorreactores no puede hacer frente a cargas tan altas; mientras que las interacciones con la centrifugación puede, es probable que se vuelva costosa y lenta y resulte en una recuperación reducida.
La floculación también puede ser efectiva, pero luego presenta un desafío de separación adicional debido a los floculantes agregados.
En este trabajo, Schirmer et al. utilizaron resinas de intercambio iónico (IEX) como paso de pretratamiento para inducir la sedimentación celular y, por lo tanto, reducir la carga en un paso posterior de filtración en profundidad.
Las tasas de sedimentación (que son proporcionales a los volúmenes de sobrenadante informados en función del tiempo) para una variedad de resinas; el mejor de estos, la politeilenimina a base de silicio o Si-PEI, también demostró proporcionar una reducción del 40 % en los niveles de proteína de la célula huésped (HCP) mediante adsorción electrostática.
Este es un enfoque inusual para resolver un problema de cultivo celular, de densidad celular extremadamente alta, que por supuesto corresponde a tasas de generación de producto muy altas, al incorporar un paso que tradicionalmente se usa para pulir mucho más aguas abajo en la fase de recuperación, para abordar la alta densidad celular mientras sigue proporcionando autorización HCP.
Estudios posteriores con cantidades variables de Si-PEI demostraron que al aumentar la cantidad de resina se reducía el nivel de células mientras se mantenía la recuperación del producto.
Felo et al. analizó un proceso de cosecha de dos pasos, siendo el primer paso la centrifugación o la filtración profunda, y el segundo paso la clarificación secundaria por filtración profunda.
El caso base fue la recolección de un biorreactor de 5000 l con una línea de células CHO para producir un mAb. La Tabla 12.3 describe el rango de valores considerado en su análisis de sensibilidad.
El resultado esencial proporcionado en la Figura 12.5 muestra que las interacciones con la centrifugación es ligeramente mejor en este estudio para volúmenes de biorreactor superiores a 5000 l. Sin embargo, esta ventaja de costo disminuyó del 6,2 % al 2,4 % a medida que el título celular aumentó de 0,5 a 10 g l−1.
Biorreactores – Mejoras en el cultivo celular
La lista de posibles interacciones y Mejoras en el cultivo celular es grande y compleja. Se pueden ver que múltiples interacciones de muchos tipos han sido reportadas en la literatura. Se necesitan más datos cuantitativos de este tipo para evaluar qué tan global debería ser el proceso de diseño, especialmente para productos en etapas tempranas del proceso de desarrollo, por ejemplo, ensayos clínicos de Fase I o II.
Estas compensaciones en biorreactores y mejoras en el cultivo celular aclaran que un bioproceso debe diseñarse globalmente: es poco probable que optimizar cada paso individualmente conduzca a un conjunto óptimo global de condiciones operativas. Un paso muy pobre puede comprometer la eficiencia de todo el bioproceso; por lo tanto, es mejor aceptar alguna disminución en el desempeño en otros pasos para mejorar sustancialmente el desempeño de este pobre paso.
Hay excepciones en cuanto a mejoras en el cultivo celular, esta interactividad entre los pasos; por ejemplo, mostró que la ingeniería celular podría mejorarse sin impactos negativos aguas abajo. Pero se debe demostrar esta falta de interactividad, que aún requiere una visión integrada de los cambios propuestos.
Tradicionalmente, los medios de cultivo celular se complementaron con el uso de suero, o con el uso de proteínas séricas como la transferrina, para mejorar las tasas de crecimiento y brindar cierta protección contra el estrés de cizallamiento. Sin embargo, estos medios eran altamente variables y complicados en el procesamiento posterior. El uso de medios químicamente definidos ha disminuido la variabilidad en todo el bioproceso.
No obstante, algunos aditivos, como los agentes antiespumantes, aún pueden tener efectos nocivos en el procesamiento posterior, por ejemplo, en la filtración y la cromatografía.
La compensación entre el aumento de la tasa de crecimiento específico y la tasa y la calidad del producto es un tema de gran importancia actual.
Srivastava et al. encontraron experimentalmente que se podían mantener altas productividades específicas y altas tasas de glicosilación para varias líneas celulares a través de la optimización de las estrategias de alimentación, es decir, no encontraron que tenían que reducir significativamente las productividades específicas para mantener altos niveles de glicosilación.
Este es un resultado extremadamente interesante, ya que la sabiduría convencional es que tal pérdida es esperable.
Matemáticamente, uno esperaría finalmente alcanzar parte de una superficie de Pareto, sobre la cual la mejora de un componente de una función objetivo multicriterio conduce inevitablemente al empeoramiento de al menos otro componente.
(Es posible que estos resultados experimentales aún no hayan alcanzado una superficie de Pareto, en cuyo caso se podrían esperar Mejoras en el cultivo celular
adicionales hasta que se alcance dicha superficie).
Es de esperar que se publiquen más resultados de este tipo, lo que permitirá que el campo alcance una comprensión más estable de esta compensación crítica.
Otra indicación de tal compensación fue publicada recientemente por Nocon et al. Construyeron un modelo a nivel de genoma para el metabolismo central de Pichia pastoris y lo utilizaron para evaluar el impacto de la sobreproducción de proteínas heterólogas en el metabolismo primario. Los resultados mostraron objetivos de sobreexpresión en la vía de las pentosas y el ciclo TCA, y objetivos de inactivación en varios puntos de ramificación en la vía de la glucólisis.
Hacer los cambios apropiados condujo a una mayor producción de la proteína heteróloga y a Mejoras en el cultivo celular, (superóxido dismutasa humana citosólica) en cinco de nueve objetivos. Sería fascinante evaluar el impacto adicional de la incorporación de variantes de proteínas, como glicoformas, para discutir el posible equilibrio entre la calidad y la cantidad del producto discutido anteriormente.
Un ejemplo interesante de ingeniería celular es la sobreexpresión de la vía de translocación de arginina gemela (Tat) en Escherichia coli.
La vía Tat, que puede exportar proteínas potencialmente valiosas que no pueden ser exportadas por la vía Sec, tiene una baja capacidad en la forma nativa.
La ingeniería de las células para sobreexpresar la vía Tat condujo a una mejora del 25 % en la tasa de crecimiento y un aumento de 40 veces en la acumulación periplásmica de la proteína deseada. Además, la integridad de la membrana no se vio afectada en las pruebas con niveles crecientes de cizallamiento.
Un modelo a escala reducida de centrifugación continua de pilas de discos predijo que la sobreexpresión de la vía Tat no afectaba a los pasos de recuperación.
Este es un caso en el que la optimización de un paso no tuvo consecuencias perjudiciales en los pasos posteriores.
Características de los bioprocesos
Un rasgo o características de los bioprocesos es la falta de información detallada sobre el perfil de impurezas en el producto final.
Esta información incompleta ha sido una razón importante para el enfoque empírico del diseño de bioprocesos incorporado en el dicho “el proceso es el producto”.
Afortunadamente, la tendencia reciente hacia la comprensión fundamental de los eventos críticos en la fabricación, impulsada por la iniciativa de «calidad por diseño» de las agencias reguladoras, y el valor cada vez mayor que se le da a los modelos sólidos de características de los bioprocesos dentro de la industria, han llevado a análisis más detallados de bioprocesos individuales y operaciones unitarias.
Sin embargo, aún existe la necesidad urgente de combinar operaciones unitarias y buscar modelos integrados y comprensión de las características de los bioprocesos. En ese contexto, este capítulo describe las interacciones entre el paso del biorreactor y los que le siguen.
Ahora se reconoce ampliamente en las características de los bioprocesos que los muchos parámetros elegidos para aumentar la eficiencia del paso de cultivo celular pueden tener consecuencias importantes para las operaciones unitarias posteriores.
Por ejemplo, se ha descubierto que el uso de sulfato de dextrano para reducir la acumulación de células promueve cambios en la estructura de las proteínas del producto, lo que a menudo acelera su agregación y reduce su vida útil.
Otro ejemplo de las características de los bioprocesos es la extensión de la duración de un biorreactor de producción para aumentar la productividad: en algunos casos, dichas operaciones prolongadas del reactor, con viabilidades celulares finales inferiores al 80 %, parecen conducir a cambios en el plegamiento de las proteínas del producto.
Sin embargo, tales interacciones en todo el bioproceso no han recibido una atención cuantitativa significativa en la literatura, a pesar de su importancia.
Este capítulo resume las interacciones entre el cultivo celular y los pasos posteriores de aislamiento, recuperación y purificación.
La clase A, que describe las métricas relevantes dentro del biorreactor, incluye las métricas habituales para la productividad del biorreactor: la tasa de crecimiento representa la eficacia con la que se producen las células y la productividad específica de la célula representa la eficacia de una única célula (promedio) en la generación producto.
Sin embargo, existen otros parámetros que son importantes para las características de bioprocesos la calidad del producto elaborado en el biorreactor, que también se enumeran en la Clase A.
Si el producto se puede encontrar en varias formas multiméricas, la fracción de la(s) forma(s) deseada(s) es una métrica importante de calidad; a menudo, el monómero es la variante deseada, y varias formas agregadas (dímero, trímero, etc.) son indeseables.
De manera similar, si el producto está apreciablemente glicosilado, el grado de glicosilación podría ser crítico. Una medida aproximada de glicosilación que se usa a menudo en la industria es la relación molar de ácido siálico al producto.
Como se analizan las características de los bioprocesos, tal relación molar puede ser engañosa; es más a menudo importante caracterizar el grado de glicosilación; en particular, la forma aglicosilada puede eliminarse tan rápidamente cuando el producto se introduce en el torrente sanguíneo de un paciente que no debe considerarse como una variante útil del producto. Las interacciones entre los parámetros dentro de la Clase A representan una forma de compensación en la optimización de la operación del biorreactor.
De la misma manera, todas las métricas de calidad del producto para todos los pasos aguas abajo del biorreactor se enumeran en la Clase B.
Esto no solo podría incluir parámetros de calidad del producto del tipo ya discutido, sino también medidas generales de eficiencia, como el rendimiento o el rendimiento, que pueden verse afectados por las condiciones del biorreactor.
Por ejemplo, si el biorreactor se ejecuta hasta una viabilidad final baja para maximizar la formación del producto, el impacto posterior de las células lisadas en los pasos de recuperación, como la centrifugación o la filtración, podría ser sustancial.
Si el costo de aumentar la cantidad de producto en el biorreactor es que el paso de filtración o centrifugación toma el doble de tiempo, y posiblemente con una reducción sustancial en el rendimiento del paso, esto puede no representar el bioproceso globalmente óptimo.
Una interacción entre cualquier métrica de la Clase B y cualquier métrica de la Clase A representa otra forma de compensación en la optimización de la operación del biorreactor. (Existe una tercera forma de compensación, que involucra dos o más métricas en la Clase B, pero está fuera del alcance de este capítulo).
Biorreactores de escala reducida.
En los biorreactores de escala reducida, aunque B. subtilis es una de las bacterias más importantes aplicadas en cultivos industriales a gran escala, hasta el momento se han publicado investigaciones muy limitadas sobre la respuesta de B. subtilis a condiciones a gran escala.
En la década de 1980, Moes et al. investigó la respuesta de B. subtilis al agotamiento transitorio de oxígeno en un reactor de dos compartimentos.
Se demostró que la relación entre la acetoína y el 2,3-butanodiol, que es muy sensible al nivel de oxígeno, en un reactor de dos compartimentos se desplaza hacia una mayor producción de 2,3-butanodiol.
Se desarrolló un modelo cinético para predecir este comportamiento en función del tiempo de mezclado. Estos resultados se utilizaron como base para investigar el efecto de las oscilaciones de pH.
El cambio de pH se estableció mediante la adición de un agente controlador de pH a la entrada del módulo PFR de un reactor de dos compartimentos y el tiempo de residencia fue ≥60 s. Se encontró que las tasas de síntesis de 2,3-butanodiol son sensibles a los cambios del valor de pH entre 6,5 y 7,2.
Los cambios en la acumulación del producto probablemente fueron causados por la sensibilidad de la acetoína y las enzimas formadoras de 2,3-butanodiol al pH y al acetato disociado.
Un estudio con B. megaterium mostró que las perturbaciones del sustrato, que fueron causadas por la aplicación de un controlador de alimentación proporcional insensible (controlador P) causaron (i) falta de aminoácidos y (ii) desbordamiento de acetato.
Al mismo tiempo, se redujo la producción de GFP como producto.
Los autores demostraron que esta menor producción podría revertirse mediante una adición adicional de los aminoácidos limitantes.
Las respuestas metabólicas de las bacterias parecen ser significativamente más rápidas en comparación con la respuesta de los eucariotas inferiores, como las levaduras.
Además, también en S. cere visiae, el metabolismo de desbordamiento se puede considerar en zonas de glucosa alta por acumulación de etanol, incluso si este compartimento se mantiene aeróbicamente.
Tales cultivos reducidos con un tiempo de circulación de 60 s podrían imitar muy bien las condiciones en una columna de burbujas de 215 m3.
Lo más interesante es que en este proceso, la calidad del producto, es decir, el poder de gasificación de la levadura de panadería fue mayor cuando el cultivo se realizó en condiciones no homogéneas, ya sea en el SDR o en la columna de producción de burbujas.
Curiosamente, también aumentó la capacidad de respiración de las células en estas condiciones oscilantes.
Datos recientes de nuestro grupo muestran que los cultivos en el sistema SDR también afectan la vía de síntesis de esteroles cuando se produce una limitación de oxígeno en la zona de alimentación de glucosa.
Los gradientes en los procesos cerveceros se han estudiado intensamente. La mezcla puede promover la evolución de CO2 y disminuir la sedimentación temprana de la levadura en la parte cónica del tanque y, por lo tanto, acortar el tiempo de fermentación en un 20 %. Tal mejora también se puede lograr mediante el uso de agitadores o dispositivos de mezcla de base de chorro en tanques de elaboración de cerveza.
Además de S. cerevisiae, se han descrito una serie de efectos de biorreactores de escala reducida para la levadura Yarrowia lipolytica, un importante productor de lipasa industrial.
Diferentes fluctuaciones ambientales pueden afectar negativamente el rendimiento de lipasa en Y. lipolytica.
Por el contrario, otros parámetros, como las oscilaciones del pH y la dispersión del sustrato inductor de oleato de metilo, conducen a menores rendimientos de biomasa y, por lo tanto, afectan indirectamente a la concentración de lipasa.
Se ha realizado mucho trabajo sobre el impacto de las oscilaciones en el área del cultivo celular.
El objetivo era principalmente evaluar la robustez de las células y su formación de productos en biorreactores de escala reducida.
Actualmente, los cultivos se realizan en recipientes de hasta 25 m3 en condiciones turbulentas.
Teniendo en cuenta el tamaño y la sensibilidad de las celdas a las condiciones hidrodinámicas, la tasa de disipación de energía específica 𝜀T juega un papel especial y también Φ, que describe la relación entre la tasa de disipación de energía específica local máxima y la tasa de disipación de energía específica promedio (𝜀T∕𝜀T) .
Mientras que 𝜀T parece estar en el orden de 0,2 W kg−1 en una configuración industrial típica, 𝜀T puede ser ~30 veces mayor (para una discusión reciente, consulte).
Datos recientes muestran que CHO y otras líneas celulares utilizadas industrialmente son relativamente robustas cuando se exponen a tales condiciones hidrodinámicas. Curiosamente, las variaciones de pH podrían influir significativamente en el número de células.
Tales desviaciones de pH del punto de control se han medido en biorreactores de cultivo celular en varios estudios (ver discusión en).
Se supone que se pueden alcanzar valores de pH de ~9,0 en puntos establecidos de ~7,2. Además, en la última fase de los cultivos, las adiciones de álcali son frecuentes (intervalo <10 s).
Dado que dichas adiciones no se dispersan por completo, el pH es más alto cerca del punto de adición que el punto establecido.
Osman et al. mostró con cultivos GS-NS0 que las oscilaciones del valor de pH pueden disminuir el número de células en un sistema STR-STR de dos compartimentos. Sin embargo, los autores no investigaron el efecto sobre la calidad del producto.
El desarrollo de sistemas de reducción de escala adecuados se está extendiendo hacia los cultivos de microbiorreactores.
Esto permite una investigación más rápida de los posibles problemas que pueden aparecer durante la ampliación.
Sin embargo, un conocimiento suficiente de biorreactores de escala reducida sigue siendo un cuello de botella importante, que solo se puede evitar en parte con los enfoques de CFD.
Sin embargo, el rápido desarrollo de herramientas de monitoreo (no invasivas) permite una reducción basada en las características fisiológicas y morfológicas de una población celular.
Los métodos, que son capaces de monitorear en línea y que reemplazan al menos parcialmente la instrumentación como la citometría de flujo fuera de línea, pueden contribuir mucho a un mejor diseño de reactores de escala reducida.
Si estas herramientas de monitoreo se miniaturizaran o se acoplaran a métodos de muestreo paralelos automatizados, la reducción podría ajustarse incluso en microbiorreactores.
La información adicional también permite refinar los modelos de balance de población y, por lo tanto, refinar los modelos híbridos.
Los diversos sistemas biorreactores de escala reducida, cuando se combinan con sistemas de muestreo automatizados, permiten la consideración de enfoques de biología de sistemas en mayor medida que la que se realiza actualmente.
La determinación exacta de la respuesta fisiológica en condiciones oscilatorias relevantes apoyará la comprensión de la célula reguladora y su ingeniería para una mayor robustez.
Por lo tanto, la ampliación y reducción de los bioprocesos exige más que nunca un enfoque interdisciplinario profundo entre las disciplinas de las ciencias naturales y la ingeniería.
Niveles de GFP en biorreactores usando reportes rpoS:GFP.
Usando un reportero rpoS:GFP, intentaron monitorear el nivel de la respuesta general al hambre basada en 𝜎S. Curiosamente, observaron una menor acumulación de niveles de GFP en biorreactores y (ii) un mayor grado de diferenciación del nivel de expresión de GFP en la población celular de los cultivos heterogéneos. Se obtuvo más información con reporteros de niveles de GFP en biorreactores inestables (mutantes gfpAAV), que se clonaron detrás de diferentes promotores.
En todos los casos (promotores probados: rrnB, fis, rpoS), los niveles de GFP en biorreactores fueron más bajos en cultivos cíclicamente perturbados en comparación con los cultivos con alimentación continua, aunque todavía es una pregunta abierta si la disminución de los niveles GFP en biorreactores se debe a la disminución de la actividad del promotor distinto o debido a una mayor actividad proteolítica en condiciones perturbadas.
¿Las condiciones no homogéneas conducen a una mayor heterogeneidad de la población? Esta interesante cuestión, que está muy relacionada con la robustez de los procesos, se estudia actualmente desde diferentes vertientes. Delvigne et al. encontraron, en experimentos con perturbaciones cíclicas, dos poblaciones de células de E. coli sobre la base de la fluorescencia del reportero de niveles de GFP en biorreactores. Cuando se recolectan y se vuelven a cultivar, estas dos poblaciones se convierten en una sola población, lo que indica que existe una heterogeneidad transitoria. La razón podría ser una heterogeneidad fenotípica, que aumenta en condiciones ambientales perturbadoras.
Han estudiado algunos investigadores el efecto del CO2 en un simulador de reducción de escala STR-STR de dos compartimentos para concentraciones de hasta 300 mbar mientras variaba los tiempos medios de circulación entre 50 y 375 s.
Como resultado, encontraron una reducción de la tasa de crecimiento específica, una mayor formación de acetato y una reducción de los niveles de GFP en biorreactores del producto recombinante en un tercio. La expresión génica solo se vio afectada por la concentración más alta de CO2.
Los ARNm de glutamato descarboxilasa (gadA) y antiportadores de glutamato/ácido 𝛾-aminobutírico (gadC) estaban elevados, y dos componentes del complejo 𝛼-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA, sucB) estaban regulados a la baja.
Esto puede indicar una inhibición de la actividad del ciclo del ácido tricarbónico, de forma similar a la observada anteriormente en E. coli.
Una pregunta interesante es si las perturbaciones pueden tener un efecto positivo en un proceso a gran escala. Otros investigadores descubrieron recientemente que una proteína heteróloga (fosfatasa alcalina), que se expresa como un producto periplásmico en E. coli, se produce a niveles más altos con un perfil de alimentación cíclica.
Curiosamente, en otro estudio, los autores descubrieron que se libera más producto en el medio de cultivo (aumento del 60 %) en cultivos con perturbaciones cíclicas en comparación con condiciones bien mezcladas y homogéneas.
Como procedimiento óptimo final, los autores proponen un perfil de alimentación triangular, que se aplica después de la inducción. Estos resultados son hasta ahora una excepción.
En la mayoría de los casos, el rendimiento de un producto recombinante disminuye significativamente por la exposición del cultivo a condiciones no homogéneas.
Esto se ha observado para una variante inestable de la proteína A, donde el menor rendimiento se relacionó con una mayor actividad proteolítica.
La alimentación cíclica de glucosa en condiciones completamente aeróbicas resultó en una alta inestabilidad proteolítica de la 𝛼-glucosidasa de levadura expresada heterólogamente en E. coli.
El ciclo entre condiciones aeróbicas y anaeróbicas conduce a una disminución significativa del rendimiento de insulina recombinante, como lo demuestra un estudio con diferentes tiempos de circulación en un sistema STR-STR de dos compartimentos.
Uno de los microorganismos industriales más importantes es C. glutamicum.
Sorprendentemente, las primeras investigaciones sobre la robustez de C. glutamicum en condiciones a gran escala consideran el desarrollo de un biorreactor especial de escala reducida con un tiempo de mezcla más prolongado (Θ90 = 130 s frente a 10 s), que se seleccionó teniendo en cuenta la entrada de potencia específica (P/V) de un reactor de producción de 10 m3.
Este aumento del tiempo de mezclado se logró implementando cinco discos fijos entre seis turbinas Rushton.
Como resultado, los cultivos en este reactor de escala reducida mostraron un crecimiento reducido (-7 %) relacionado con un menor consumo de azúcar y amoníaco y una menor producción de lisina (-12 %). Sin embargo, C. glutamicum parece ser relativamente robusta.
Ni el estrés mecánico extremo ni la alta aireación o las bajas concentraciones de oxígeno disuelto causaron una respuesta fisiológica significativa.
Esta elevada robustez de C. glutamicum, que podría ser una de las razones de su extraordinario éxito industrial, también fue confirmada por los estudios realizados por Käß et al.
Estudiaron el impacto de la zona de alimentación (acceso de glucosa concomitante y limitación de oxígeno) en un sistema de reactor de dos compartimentos que consiste en un STR aireado acoplado a un módulo PFR no aireado.
Los autores aplicaron diferentes cepas, una cepa de tipo salvaje y una superproductora de lisina, y diferentes tiempos de residencia en el módulo PFR de hasta 3 min.
Curiosamente, solo se encontraron diferencias en la acumulación de lactato, pero no hubo reducción del rendimiento del crecimiento ni pérdidas de productividad.
Recientemente, se realizaron cultivos en reactores de dos y tres compartimentos con C. glutamicum y se compararon con un cultivo STR estándar.
Mientras que el STR estaba aireado, los dos PFR acoplados no estaban aireados: uno con adición de alimento y el segundo sin él.
Los resultados mostraron que el lactato y el succinato, así como una serie de aminoácidos (glicina, treonina, glutamato, glutamina), que se derivan del metabolismo central del carbono, se acumularon hasta el doble en el cultivo del reactor de tres compartimentos que en el de dos. cultivo en reactor compartimental.
En contraste con el cultivo en reactor de dos compartimentos, no se observa acumulación intracelular de piruvato en el cultivo en reactor de tres compartimentos, ya que los flujos de carbono se dirigen hacia el lactato.
Esta adaptación de las células, que puede considerarse exitosa, se revela mediante un análisis de citometría de flujo de células teñidas con BOX y una serie de mediciones electroópticas en línea de la polarizabilidad celular.
Ambos métodos indican una mayor polarizabilidad de las células en el cultivo del reactor de tres compartimentos.
La tinción con PI no indica ningún daño significativo en la membrana ni muerte celular acelerada en ninguno de los sistemas.
Sin embargo, aunque la cepa muestra robustez, el rendimiento del producto de lisina se redujo en cultivos reducidos, lo que subraya la importancia de la optimización del proceso.
Recientemente, Buchholz investigó el efecto de los niveles oscilantes de CO2/HCO3 en un biorreactor en cascada de tres compartimentos sobre el rendimiento de biomasa, así como el metaboloma y la respuesta transcripcional de una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum y un productor de lisina.
El tiempo de residencia en el ambiente elevado de CO2/HCO3 se ajustó a 3,6 min a una relación de volumen de 8,4%, lo que pareció ser relevante para la escala de producción industrial.
Se aplicaron gradientes de presión de pCO2 de 75-315 mbar.
Aunque más de 60 genes se regularon hacia arriba o hacia abajo en estas condiciones según el gradiente de presión y el tiempo de residencia, no se encontraron cambios notables en la concentración de biomasa y producto en comparación con el cultivo de referencia.
Estos hallazgos interesantes indican no solo una fuerte respuesta a la disponibilidad oscilante de CO2, sino también una alta robustez de C. glutamicum, aunque quedan por resolver los mecanismos detallados.
Experimentos en biorreactores de glucosa de E. coli
La glucosa de E. coli responde a las perturbaciones repetidas mediante la formación de productos secundarios de la glucólisis cuando las células se exponen a una alta concentración de glucosa.
Se han realizado muchos experimentos para investigar esta respuesta en varios diseños de biorreactores.
La respuesta se ve afectada por la tensión y la tasa de crecimiento específica, la concentración de glucosa en el punto de alimentación, es decir, la intensidad del cambio y el tiempo de residencia en la zona de alimentación.
Parece que la respuesta celular a un cambio de glucosa es al menos bifásica, por lo que la primera fase relacionada con el llenado de la derivación de la glucólisis es muy rápida, incluso menos de 5 s.
La capacidad de las células para absorber glucosa no sólo depende de la tasa de crecimiento específica real, sino que también está influida por la historia del cultivo.
La respuesta se ve fuertemente afectada por la disponibilidad de oxígeno en la zona de alimentación.
Parece que las células de glucosa de E. coli responden de manera diferente a pulsos únicos y perturbaciones repetidas.
Mientras en algunas pruebas se detectó una mayor capacidad de absorción específica de las células, que fueron expuestas a un pulso de glucosa anaeróbica en comparación con las células expuestas a un pulso de glucosa aeróbica (31 frente a 15 mmol g-1 h-1) en un experimento de pulso único en la unidad de muestreo rápido BioScope, Por su parte Neubauer detectó una alta capacidad similar para la captación de glucosa en un sistema de reactor de dos compartimentos donde el compartimento PFR, que simulaba la zona de alimentación, se caracterizaba al menos parcialmente por la limitación de oxígeno en comparación con las condiciones completamente aeróbicas.
Sin embargo, esta capacidad disminuyó con la disminución de la tasa de crecimiento específica a lo largo del cultivo discontinuo alimentado con glucosa limitada.
En general, los datos disponibles sugieren que la capacidad de captación de glucosa de E. coli puede ser más de un orden de magnitud superior en condiciones de glucosa limitada que la tasa de captación de glucosa específica durante una fase discontinua.
Si bien el tiempo del ciclo, durante el cual las células estuvieron expuestas a pulsos de glucosa, parece no tener un efecto importante en el flujo central de glucosa de E. coli en los dos intervalos estudiados (7 y 18 min), el tiempo del ciclo puede influir fuertemente en otras respuestas. y por lo tanto el resultado de un proceso.
En un estudio con cambios regulares en la tasa de alimentación, Lin et al. observaron que la expresión de un producto recombinante y el sobrecrecimiento de una población celular libre de plásmidos se vieron fuertemente afectados por la duración de un ciclo de alimentación en un rango entre 1 y 4 min.
La respuesta metabólica de glucosa de E. coli a pulsos repetidos de glucosa incluye la formación de productos de desbordamiento glucolítico o incluso una fermentación ácida mixta completa si el cultivo estuvo expuesto a la limitación de oxígeno simultáneamente.
Esto incluye la acumulación de acetato, D-lactato, formiato, succinato e hidrógeno. Sin embargo, aún no se ha establecido un modelo de flujo metabólico bajo estas condiciones.
Los metabolitos acumulados se remetabolizan parcialmente en otras partes del reactor con tanques de acero inoxidable, en las que la glucosa es limitada o se agota.
Por lo tanto, en los procesos industriales no se puede concluir que no existen efectos de zona de alimentación, si estos metabolitos no se encontraron en el análisis.
La única excepción es el formiato, que se remetaboliza lentamente y, por lo tanto, se ha considerado como un indicador de los efectos de la zona de alimentación.
Sin embargo, la acumulación de formiato se reduce considerablemente si los medios de fermentación contienen los elementos selenio, níquel y molibdeno, que son necesarios para un complejo funcional de formiato-hidrógeno liasa.
Luego, el formato se convierte en hidrógeno y esto es apenas detectable.
Además de la acumulación de productos típicos de fermentación de ácidos mixtos, la aparición simultánea de altas concentraciones de glucosa y la limitación de oxígeno dan como resultado la acumulación de piruvato.
Esto, a su vez, puede aumentar el flujo hacia las vías de los aminoácidos vecinales y puede resultar en una acumulación de alanina, valina e incluso en la formación del aminoácido no canónico norvalina.
Las condiciones oscilantes no solo provocan respuestas metabólicas, sino que también afectan la expresión de genes celulares y la composición de proteínas.
Los experimentos de Schweder et al. probar que un tiempo de residencia de 1 min en una zona de alimentación de glucosa de un reactor de dos compartimentos es lo suficientemente largo como para inducir varios ARNm.
Los autores detectaron un aumento múltiple de los ARNm, que son típicos del estrés osmótico, el estrés general y la limitación de oxígeno.
Ya era visible un aumento en el primer punto de muestreo del reactor de dos compartimentos para algunos de estos ARNm (proU, dnaK y pfl), es decir, dentro de los 13 s después de un pulso de glucosa.
En un estudio muy reciente, Brognaux et al. investigó la liberación de proteínas celulares en el medio extracelular.
Aunque normalmente se sabe que E. coli posee muy pocas proteínas secretadas, se sabe que puede producirse una liberación de proteínas desde el periplasma en cultivos más antiguos y después de la sobreexpresión de proteínas en el periplasma de E. coli. Los estudios sugieren que la aparición de proteínas en el medio extracelular en cultivos de alta densidad celular de E. coli no está necesariamente relacionada con la lisis celular.
Brognaux et al. demostraron que esta liberación de proteínas intracelulares está relacionada con un cambio en la permeabilidad de la membrana celular y, lo que es más importante, que esta liberación es más fuerte en cultivos homogéneos de lote alimentado con glucosa limitada en comparación con cultivos oscilantes.
Este trabajo apoya fuertemente las observaciones anteriores de los análisis de citometría de flujo de Hewitt y sus colegas, que muestran que las células cultivadas en condiciones a gran escala pueden exhibir una mayor viabilidad.
Experimentos de reducción de escala y respuestas fisiológicas
Los experimentos de reducción de escala son particularmente cruciales para el modelado exitoso de de los sistemas así como el acoplamiento de los fenómenos de transporte físico y la actividad biológica en un modelo.
Se ha aplicado el enfoque del modelo compartimental (CMA) para generar un modelo que incluía consideraciones cinéticas y se basaba en el conocimiento general de la hidrodinámica de los reactores de tanque agitado, tanto aireados como no aireados.
Se estableció un modelo para la expresión de enzimas celulósicas por el hongo filamentoso Trichoderma reesei, en el que la viscosidad y la influencia en la transferencia de masa tenían el efecto más pronunciado en el resultado del modelo.
Morchain et al. simuló un fermentador aireado en reducción de escala de laboratorio (70 l) y a escala industrial (70 m3) con un enfoque de Euler-Euler para la fase líquida y gaseosa.
Se acopló a un modelo de balance poblacional, que reflejaba la adaptación a gradientes y un modelo cinético para la estimación de tasas de recambio bioquímico.
La tasa de crecimiento fue elegida como el parámetro discriminante entre las dos subpoblaciones.
Se observó una región distinta de alta concentración de sustrato y una alta absorción concomitante de sustrato para cada caso: alimentación desde la parte superior o desde la parte inferior. Se encontró que el crecimiento era espacialmente bastante independiente.
Los autores señalaron las diferencias estimadas entre la tasa de absorción y la tasa de crecimiento como una fuente importante de perturbación.
La evolución de gradientes ha sido estudiada mediante un modelo de paseo aleatorio sesgado (BRWM) capaz de reproducir el desplazamiento de microorganismos dentro de la parte no mezclada de un reactor en reducción de escala reducida.
El modelo es capaz de simular células individuales de una población microbiana que atraviesa el reactor. Se ha utilizado anteriormente para caracterizar el oxígeno disuelto y los gradientes de sustrato experimentados por una sola célula microbiana en un reactor a gran escala.
Se encontró que la tasa de producción local de butanodiol es una función de la entrada de energía local en una fermentación por lotes de Bacillus subtilis acoplando un modelo mecánico a funciones parametrizadas de la transferencia de masa (gas) en biorreactores agitados basados en estudios CFD.
Se aplicó una metodología similar para estimar la disponibilidad de glucosa y los gradientes concomitantes en un cultivo por lotes con alimentación de E. coli en la escala de metros cúbicos.
Especialmente, los resultados de este informe representan la base para muchos experimentos de reducción.
Es necesario realizar más modelos híbridos específicos de casos, ya que se pueden cuantificar los gradientes, que luego se imitan a escala de laboratorio y, por lo tanto, proporcionan datos valiosos a gran escala.
Una comprensión integral de la fisiología celular en biorreactores no homogéneos en reducción de escala industrial es uno de los grandes desafíos de la biotecnología aplicada.
La importancia de los tiempos de respuesta y relajación de los sistemas biológicos se reconoció anteriormente.
Sin embargo, todavía existe una brecha científica entre los esfuerzos fundamentales realizados para comprender la regulación molecular de las redes celulares y la implicación de este conocimiento en las condiciones dinámicas de los bioprocesos.
Los problemas clave para comprender las respuestas interactivas a las faltas de homogeneidad de un sistema celular complejo están relacionados con los siguientes parámetros:
Comprensión limitada de la dinámica del reactor. Puede ser imposible mapear los parámetros químicos y físicos que varían dinámicamente en un biorreactor a gran escala a lo largo del tiempo y el lugar. Los modelos actuales y los métodos de reducción de escala consideran solo unos pocos parámetros. Sin embargo, la celda responderá a las distintas condiciones locales y también responderá a pequeños cambios mientras se mueve a través del reactor.
Comprensión limitada de la cinética de las redes de respuesta celular. La respuesta y adaptación de las células a las condiciones locales ocurren en diferentes horizontes de tiempo, por ejemplo, por flujos metabólicos, por expresión de proteínas o por reorganización de sistemas de membrana. El movimiento de una celda a través de diferentes zonas de un reactor puede ser más rápido que la respuesta. Por lo tanto, la respuesta puede detectarse solo en un sitio diferente del sitio donde se activó.
Comprensión limitada de los efectos de la historia celular. La respuesta de una célula depende de la tasa de crecimiento específica, que a su vez está influenciada por las condiciones ambientales locales y la historia de las condiciones ambientales cambiantes dinámicas experimentadas.
Uso limitado de herramientas técnicas para la medición y el muestreo. Actualmente, rara vez se aplican métodos para recolectar muestras representativas de un biorreactor a gran escala de diferentes sitios en el líquido a granel del reactor, aunque dichos dispositivos de sonda se conocen para biorreactores a pequeña escala. Es necesaria una atención especial para la estabilización inmediata de las muestras, que se recolectan de la fase líquida central de un biorreactor a gran escala, porque su estado puede cambiar en el sistema de muestreo debido a las respuestas metabólicas rápidas, especialmente si se consideran rutas de muestreo largas y si las densidades celulares son altas. Además, la disponibilidad de sensores en línea, que se pueden colocar libremente en diferentes ubicaciones de un biorreactor a gran escala, es limitada.
Medición de gradientes en biorreactores
Para investigar la aparición y medición de gradientes de glucosa, Larsson et al. Realizó un muestreo en tres partes (zona superior/media/inferior) de un cultivo de 30 m3.
El desafío en la medición de gradientes definidos con muestreo y análisis fuera de línea radica en la rápida inactivación de la actividad metabólica de la célula. Muchos enfoques originalmente inventados y aplicados para obtener una alta frecuencia de muestreo después de un pulso de glucosa con el fin de realizar estudios de biología de sistemas pueden transferirse para seguir la formación y medición de gradientes a gran escala.
Recientemente, se estableció un dispositivo multiposición y multisensor para la observación y medición de gradientes para su aplicación en procesos de fermentación anaeróbica. Estos consistían en sondas de sensores disponibles en el mercado para aplicaciones esterilizables.
Los sensores estaban equipados con amplificadores ya directamente en el sensor, lo que permitía la transmisión de datos a largas distancias. Los sensores estaban montados en una caja de acero resistente al agua que estaba conectada a un cordón que permitía un movimiento flexible en la fase líquida.
Mientras que tres sensores (por ejemplo, pH, redox y oxígeno disuelto (en relación con la temperatura)) se combinaron en una sola caja de un diámetro de 76 mm, las soluciones del Instituto Kurt-Schwabe (Meinsberg, Alemania) permitieron la combinación de seis parámetros con microsensores bioquímicos.
Estos sensores se conectaron a una lanza de acero para la medición de gradientes en reactores de biogás. Para la aplicación en tanques de elaboración de cerveza a escala industrial, las cabezas de los sensores se guiaron a través de una línea de pesca.
Nienow et al. realizó un estudio en tanques cerveceros de nivel mínimo de llenado superior a 1600 h l-1. Se tomaron ocho sondas de biomasa a diferentes alturas de un fermentador de cerveza, guiadas a través de un brazo articulado y un cabrestante.
Esta aplicación es factible cuando no se instalan partes móviles como agitadores. En la fermentación de cerveza se aplicó velocimetría Doppler ultrasónica (UDV) a una escala de 270 l para determinar los campos de velocidad con 128 puntos de medición. Se tomaron medidas en el fluido turbio con las células de levadura existentes como partículas trazadoras en él. En general, los avances recientes en sensores ópticos permitirán el reconocimiento de patrones de flujo de partículas más fácilmente en el futuro.
Se han realizado muchos enfoques para estudiar y predecir la distribución espacial del oxígeno disuelto en reactores de tanque agitado. Por lo tanto, la estimación correcta del tamaño de la burbuja y, por lo tanto, del área superficial, es de fundamental importancia.
Se han analizado varios enfoques que se basan en una compartimentación de la fase líquida para una mejor comprensión de la mezcla en los biorreactores de tanque agitado a gran escala.
Los primeros estudios describieron la simulación del rendimiento del agitador y la transferencia de masa en biorreactores multiturbina de escala industrial. La aplicación de este enfoque proporciona un método para determinar los perfiles de oxígeno disuelto axial en condiciones de velocidades de transferencia de masa conocidas en función de la agitación y la aireación.
El biorreactor está dividido en varias celdas de mezcla, lo que permite considerar la transferencia de masa en cada turbina individualmente.
La estructura del enfoque de modelado puede servir como base para probar las correlaciones de una sola turbina y adaptarlas a sistemas de varias turbinas. El software CFD se usó para simular campos de flujo relacionados con las condiciones del lote alimentado resolviendo las ecuaciones de Navier-Stokes de un modelo de compartimiento usando el modelo de turbulencia.
Las partículas trazadoras se liberaron desde una zona de referencia dentro de los campos de flujo simulados, y se calculó el tiempo que necesitaron estas partículas trazadoras para regresar a la zona de referencia. Se presentó otro método para estimar el tiempo de mezclado en reactores industriales agitados por turbinas Rushton en condiciones aireadas y se denominó modelo analógico de tiempo de mezclado. Se basa en la hipótesis de la analogía del tiempo de mezclado a la misma velocidad de agitación de la turbina en fases gas-líquido.
Además, se demostró que la geometría interna del reactor, el número de impulsores, la distancia entre los impulsores y el grado de homogeneidad son menos sensibles al resultado del modelo. Se estimaron los gradientes de concentración en uno de los reactores estudiados (12 m3 de volumen) tanto en la inyección superior como en la inferior, ambos situados en fase líquida.
Rhanganatan y Sivaraman aplicaron CFD multifásico junto con un método de balance de población para estudiar la hidrodinámica y la transferencia de masa en un reactor de tanque de acero agitado de turbina dual gas-líquido. Solo la ubicación en la que se inyectan los pulsos influye en los parámetros del modelo. Se estimaron los gradientes de concentración en uno de los reactores estudiados (12 m3 de volumen) tanto en la inyección superior como en la inferior, ambos situados en fase líquida.
Rhanganatan y Sivaraman aplicaron CFD multifásico junto con un método de balance de población para estudiar la hidrodinámica y la transferencia de masa en un reactor de tanque agitado de turbina dual gas-líquido. Se utiliza un método de estado estacionario de marco de referencia múltiple (MFR) para modelar las regiones del impulsor y del tanque.
El equilibrio de la población de burbujas se considera utilizando ecuaciones de flujo polidisperso homogéneo y no homogéneo para tener en cuenta la distribución del tamaño de la burbuja debido a la ruptura y coalescencia de las burbujas. Los hallazgos descritos anteriormente fueron emparejados.
Alves et al. encontró que para las turbinas Rushton, el tamaño de la burbuja aumenta desde la punta del agitador a lo largo de la corriente de descarga. Los tamaños de las burbujas en las soluciones de electrolitos son más pequeños y más sensibles a la entrada de energía que en el agua.
La adición de tensioactivos da como resultado una mayor disminución del tamaño de la burbuja y debe tenerse en cuenta para la predicción basada en modelos de la transferencia de masa de gas.
Condiciones de biorreactores a gran escala
Para obtener un conocimiento suficiente de las condiciones de biorreactores a gran escala, la recopilación de datos experimentales es absolutamente necesaria.
Sin embargo, las condiciones de “buenas prácticas de fabricación” (GMP, por sus siglas en inglés) que se realizan habitualmente en la industria farmacéutica no permiten la instalación de equipos sofisticados para la elucidación de gradientes dentro de un biorreactor.
Esta es, entre el riesgo de perder datos confidenciales de bioprocesos, la razón principal de la escasez de datos disponibles de biorreactores a gran escala.
Todavía no se sabe mucho sobre la distribución de los gradientes de concentración. Los sistemas de monitoreo adecuados en biorreactores a gran escala deben, por lo tanto, poseer las siguientes características: (i) la perturbación del campo de fluido debe ser apenas reconocible, (ii) el método de monitoreo debe ser no invasivo o al menos montarse en los puertos disponibles, (iii) ) la esterilidad del proceso no debe verse afectada, y (iv) el método de seguimiento debe ser capaz de identificar gradientes de parámetros relevantes con una resolución suficiente.
Estas características difícilmente se combinan en ningún sistema. Por lo tanto, se debe hacer un compromiso. Especialmente, no se puede asegurar la esterilidad, por ejemplo, cuando se aplican sensores multiposición. Sin embargo, la posición flexible de un sensor es un requisito previo para la determinación de zonas críticas y gradientes entre ellas. Una forma de eludir este problema es centrarse en procesos con bajos requisitos de esterilidad, al menos procesos que no sean GMP.
Los procesos para la producción de materias primas, alimentos, biocombustibles y biogás podrían ser objetivos adecuados, ya que estos procesos no suelen requerir una esterilidad absoluta en los tanques de acero, al menos no a escala de producción antes de la terminación, cuando los gradientes han evolucionado en su mayor medida.
Un enfoque bastante simple para la detección de gradientes de oxígeno disuelto es el montaje de sensores de OD típicamente aplicados a diferentes alturas del biorreactor.
El método dinámico (el oxígeno se elimina mediante nitrógeno (gasificación) o el oxígeno se rocía en una fase líquida anóxica en un reactor (gasificación)) es un método adecuado que proporciona datos de la transferencia de masa de oxígeno cuando el tiempo de respuesta del electrodo de OD es menor que el valor kLa.
Se pueden seguir enfoques similares para la determinación de la disolución de dióxido de carbono. En este caso, se puede aplicar un electrodo de pH para seguir el cambio de pH causado por el dióxido de carbono disuelto. Varias revisiones describen la comparación de diferentes métodos y aplicaciones para la determinación del valor de kLa.
El efecto de una mezcla insuficiente, es decir, una entrada de energía insuficiente con respecto al volumen de líquido, provoca gradientes de sustratos, cofactores como el oxígeno disuelto y productos.
Con el fin de investigar el aporte de oxígeno a un cultivo de Streptomyces en la escala de 112 m3, Manfredini et al. instaló una sonda de temperatura y OD verticalmente flexible que se montó en una plataforma de acero.
Podría fijarse en cada posición en el bulto en la fase líquida.
Las mediciones estáticas de oxígeno disuelto y temperatura a diversas concentraciones de biomasa seca y, por lo tanto, la viscosidad produjeron gradientes a lo largo de la altura del biorreactor.
Si bien se pudo mantener una concentración de oxígeno disuelto de hasta el 65 % cerca del rociador durante todo el cultivo, se observó una clara reducción en la parte superior, donde solo se pudo medir el 30 % de la saturación.
No se detectaron gradientes de temperatura relevantes. Oosterhuis realizó un enfoque similar para detectar gradientes de oxígeno.
De manera similar al enfoque mencionado anteriormente, se montó un electrodo polarográfico a lo largo de un cable, que a su vez se montó en un tubo en la parte inferior y superior en un biorreactor con un volumen de trabajo de 19 m .
Por lo tanto, el sensor podría moverse libremente en dirección vertical. Las mediciones se evaluaron en condiciones de producción. Se midió una concentración de saturación desde >90% cerca del rociador hasta <5% entre los impulsores.
Se estableció una indicación rápida del tiempo de mezcla mediante un agente decolorante dependiente del pH y análisis de video.
El método permite una estimación global del tiempo de mezclado. El método aplicado por Alves et al. Se basó en pequeños capilares en los que la fase gas-líquido fue succionada en múltiples posiciones. Las burbujas estaban bien separadas entre sí por la fase líquida. El tiempo de mezcla se estimó en un biorreactor tubular de rotación horizontal utilizando un método de temperatura escalonada a varias velocidades de rotación en una sala con temperatura controlada.
Debido a las diferentes características ópticas de la fase gaseosa y líquida, se realizó una separación con métodos foto ópticos. Otros estudios describen la aplicación de un sistema basado en celdas de flujo en el que se fotografiaron las burbujas. Se mejoró la sensibilidad de las técnicas foto ópticas no intrusivas para que se pudiera detectar un diámetro mínimo de burbuja de 40 μm.
Un parámetro de proceso importante, que afecta la disponibilidad de oxígeno, es la entrada de energía P. Si bien existen gradientes en biorreactores a gran escala, la entrada de energía puede considerarse libre de gradientes cuando solo se considera la entrada de energía basada en el agitador. Puede medirse con dinamómetros de torsión, o en base al balance de calor en un recipiente aislado independiente de la escala. Debido a la facilidad de las mediciones, la potencia de entrada se ha utilizado como parámetro de escalado en muchos estudios.
Estudios propios incluso revelaron una correlación válida entre la potencia de entrada del agitador medida en el eje del agitador, que era necesaria para mantener la velocidad del agitador, y la viscosidad del caldo de cultivo en un biorreactor de flujo pistón a escala industrial para la producción de biogás.
Dado que la viscosidad afecta en gran medida la separación de zonas y la alta viscosidad favorece la formación de gradientes, la potencia de entrada debe ajustarse si es posible para evitar un aumento en el tiempo de mezcla.
Sin embargo, este parámetro se puede determinar con facilidad y precisión incluso a gran escala de forma no invasiva.
Desafíos más severos durante la ampliación de biorreactores
Hasta ahora, la ampliación de biorreactores se suele realizar mediante un conjunto de experimentos elegidos al azar, que se realiza de acuerdo con la infraestructura disponible.
Rara vez se realiza sobre la base de modelos matemáticos, que describen el comportamiento a gran escala de un proceso basado en experimentos a escala de laboratorio (y probablemente enfoques de reducción de escala adecuados, que se realizaron con anticipación).
Estos enfoques empíricos evolucionan de manera iterativa y se basan en gran medida en las experiencias de los desarrolladores.
Si se logra un cierto grado de reproducibilidad en biorreactores y tanques entre la escala piloto y la de producción, la ampliación generalmente se considera exitosa.
La falta de datos dentro de la comunidad científica sobre los rendimientos de la ampliación de biorreactores y la propia escala industrial dificulta un enfoque científico detallado.
Dado que solo se dispone de datos muy limitados, muchos enfoques no pudieron evaluarse para varios casos.
Naturalmente, los modelos disponibles, que intentan predecir el comportamiento a gran escala, solo pueden ser tan buenos como los datos (en cantidad y calidad) en los que se basan.
Se necesitan mayores esfuerzos para compartir datos entre la industria y la ciencia cuando se deben lograr avances. Un ejemplo es la evolución de modelos de flujo de fluidos refinados y, por lo tanto, mejorados.
Si bien los modelos básicos ya se derivaron hace una década, la alta resolución será factible solo si se pueden obtener suficientes datos de la distribución de sustrato, oxígeno y dióxido de carbono, incluida la burbuja de gas y el tamaño de la celda, mediante métodos de monitoreo adecuados.
Las diferencias de los números de Reynolds a una entrada de energía y una velocidad del agitador similares en diferentes escalas conducen a variaciones en la transferencia de masa y calor.
Sin embargo, las grandes diferencias debidas a las diversas aplicaciones biotecnológicas son aún de mayor importancia.
Por ejemplo, un cultivo de hongos necesita un desarrollo de parámetros de ingeniería tradicionales que es diferente de un cultivo bacteriano debido a los cambios de viscosidad.
Por lo tanto, el conocimiento limitado sobre el comportamiento a gran escala a menudo no es transferible de una investigación a otra.
Los problemas de los diferentes comportamientos de las células a gran escala debido a las faltas de homogeneidad en la fase líquida están contrarrestando los beneficios del aumento de escala.
Cualquier mejora se basa en la definición correcta de las condiciones a gran escala para simular adecuadamente estas condiciones en una escala más pequeña como un enfoque iterativo que se basa en principios de calidad por diseño y optimización de procesos basada en modelos en combinación con ingeniería de tensión.
Es necesario superar la falta de datos para hacer frente a los problemas actuales de ampliación mediante el diseño de sistemas de reducción más adecuados.
Un conjunto adecuado de modelos basados en datos relevantes es un requisito previo para lograr este objetivo.
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