Experimentos en biorreactores de glucosa de E. coli
La glucosa de E. coli responde a las perturbaciones repetidas mediante la formación de productos secundarios de la glucólisis cuando las células se exponen a una alta concentración de glucosa.
Se han realizado muchos experimentos para investigar esta respuesta en varios diseños de biorreactores.
La respuesta se ve afectada por la tensión y la tasa de crecimiento específica, la concentración de glucosa en el punto de alimentación, es decir, la intensidad del cambio y el tiempo de residencia en la zona de alimentación.
Parece que la respuesta celular a un cambio de glucosa es al menos bifásica, por lo que la primera fase relacionada con el llenado de la derivación de la glucólisis es muy rápida, incluso menos de 5 s.
La capacidad de las células para absorber glucosa no sólo depende de la tasa de crecimiento específica real, sino que también está influida por la historia del cultivo.
La respuesta se ve fuertemente afectada por la disponibilidad de oxígeno en la zona de alimentación.
Parece que las células de glucosa de E. coli responden de manera diferente a pulsos únicos y perturbaciones repetidas.
Mientras en algunas pruebas se detectó una mayor capacidad de absorción específica de las células, que fueron expuestas a un pulso de glucosa anaeróbica en comparación con las células expuestas a un pulso de glucosa aeróbica (31 frente a 15 mmol g-1 h-1) en un experimento de pulso único en la unidad de muestreo rápido BioScope, Por su parte Neubauer detectó una alta capacidad similar para la captación de glucosa en un sistema de reactor de dos compartimentos donde el compartimento PFR, que simulaba la zona de alimentación, se caracterizaba al menos parcialmente por la limitación de oxígeno en comparación con las condiciones completamente aeróbicas.
Sin embargo, esta capacidad disminuyó con la disminución de la tasa de crecimiento específica a lo largo del cultivo discontinuo alimentado con glucosa limitada.
En general, los datos disponibles sugieren que la capacidad de captación de glucosa de E. coli puede ser más de un orden de magnitud superior en condiciones de glucosa limitada que la tasa de captación de glucosa específica durante una fase discontinua.
Si bien el tiempo del ciclo, durante el cual las células estuvieron expuestas a pulsos de glucosa, parece no tener un efecto importante en el flujo central de glucosa de E. coli en los dos intervalos estudiados (7 y 18 min), el tiempo del ciclo puede influir fuertemente en otras respuestas. y por lo tanto el resultado de un proceso.
En un estudio con cambios regulares en la tasa de alimentación, Lin et al. observaron que la expresión de un producto recombinante y el sobrecrecimiento de una población celular libre de plásmidos se vieron fuertemente afectados por la duración de un ciclo de alimentación en un rango entre 1 y 4 min.
La respuesta metabólica de glucosa de E. coli a pulsos repetidos de glucosa incluye la formación de productos de desbordamiento glucolítico o incluso una fermentación ácida mixta completa si el cultivo estuvo expuesto a la limitación de oxígeno simultáneamente.
Esto incluye la acumulación de acetato, D-lactato, formiato, succinato e hidrógeno. Sin embargo, aún no se ha establecido un modelo de flujo metabólico bajo estas condiciones.
Los metabolitos acumulados se remetabolizan parcialmente en otras partes del reactor con tanques de acero inoxidable, en las que la glucosa es limitada o se agota.
Por lo tanto, en los procesos industriales no se puede concluir que no existen efectos de zona de alimentación, si estos metabolitos no se encontraron en el análisis.
La única excepción es el formiato, que se remetaboliza lentamente y, por lo tanto, se ha considerado como un indicador de los efectos de la zona de alimentación.
Sin embargo, la acumulación de formiato se reduce considerablemente si los medios de fermentación contienen los elementos selenio, níquel y molibdeno, que son necesarios para un complejo funcional de formiato-hidrógeno liasa.
Luego, el formato se convierte en hidrógeno y esto es apenas detectable.
Además de la acumulación de productos típicos de fermentación de ácidos mixtos, la aparición simultánea de altas concentraciones de glucosa y la limitación de oxígeno dan como resultado la acumulación de piruvato.
Esto, a su vez, puede aumentar el flujo hacia las vías de los aminoácidos vecinales y puede resultar en una acumulación de alanina, valina e incluso en la formación del aminoácido no canónico norvalina.
Las condiciones oscilantes no solo provocan respuestas metabólicas, sino que también afectan la expresión de genes celulares y la composición de proteínas.
Los experimentos de Schweder et al. probar que un tiempo de residencia de 1 min en una zona de alimentación de glucosa de un reactor de dos compartimentos es lo suficientemente largo como para inducir varios ARNm.
Los autores detectaron un aumento múltiple de los ARNm, que son típicos del estrés osmótico, el estrés general y la limitación de oxígeno.
Ya era visible un aumento en el primer punto de muestreo del reactor de dos compartimentos para algunos de estos ARNm (proU, dnaK y pfl), es decir, dentro de los 13 s después de un pulso de glucosa.
En un estudio muy reciente, Brognaux et al. investigó la liberación de proteínas celulares en el medio extracelular.
Aunque normalmente se sabe que E. coli posee muy pocas proteínas secretadas, se sabe que puede producirse una liberación de proteínas desde el periplasma en cultivos más antiguos y después de la sobreexpresión de proteínas en el periplasma de E. coli. Los estudios sugieren que la aparición de proteínas en el medio extracelular en cultivos de alta densidad celular de E. coli no está necesariamente relacionada con la lisis celular.
Brognaux et al. demostraron que esta liberación de proteínas intracelulares está relacionada con un cambio en la permeabilidad de la membrana celular y, lo que es más importante, que esta liberación es más fuerte en cultivos homogéneos de lote alimentado con glucosa limitada en comparación con cultivos oscilantes.
Este trabajo apoya fuertemente las observaciones anteriores de los análisis de citometría de flujo de Hewitt y sus colegas, que muestran que las células cultivadas en condiciones a gran escala pueden exhibir una mayor viabilidad.