Niveles de GFP en biorreactores usando reportes rpoS:GFP.
Usando un reportero rpoS:GFP, intentaron monitorear el nivel de la respuesta general al hambre basada en 𝜎S. Curiosamente, observaron una menor acumulación de niveles de GFP en biorreactores y (ii) un mayor grado de diferenciación del nivel de expresión de GFP en la población celular de los cultivos heterogéneos. Se obtuvo más información con reporteros de niveles de GFP en biorreactores inestables (mutantes gfpAAV), que se clonaron detrás de diferentes promotores.
En todos los casos (promotores probados: rrnB, fis, rpoS), los niveles de GFP en biorreactores fueron más bajos en cultivos cíclicamente perturbados en comparación con los cultivos con alimentación continua, aunque todavía es una pregunta abierta si la disminución de los niveles GFP en biorreactores se debe a la disminución de la actividad del promotor distinto o debido a una mayor actividad proteolítica en condiciones perturbadas.
¿Las condiciones no homogéneas conducen a una mayor heterogeneidad de la población? Esta interesante cuestión, que está muy relacionada con la robustez de los procesos, se estudia actualmente desde diferentes vertientes. Delvigne et al. encontraron, en experimentos con perturbaciones cíclicas, dos poblaciones de células de E. coli sobre la base de la fluorescencia del reportero de niveles de GFP en biorreactores. Cuando se recolectan y se vuelven a cultivar, estas dos poblaciones se convierten en una sola población, lo que indica que existe una heterogeneidad transitoria. La razón podría ser una heterogeneidad fenotípica, que aumenta en condiciones ambientales perturbadoras.
Han estudiado algunos investigadores el efecto del CO2 en un simulador de reducción de escala STR-STR de dos compartimentos para concentraciones de hasta 300 mbar mientras variaba los tiempos medios de circulación entre 50 y 375 s.
Como resultado, encontraron una reducción de la tasa de crecimiento específica, una mayor formación de acetato y una reducción de los niveles de GFP en biorreactores del producto recombinante en un tercio. La expresión génica solo se vio afectada por la concentración más alta de CO2.
Los ARNm de glutamato descarboxilasa (gadA) y antiportadores de glutamato/ácido 𝛾-aminobutírico (gadC) estaban elevados, y dos componentes del complejo 𝛼-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA, sucB) estaban regulados a la baja.
Esto puede indicar una inhibición de la actividad del ciclo del ácido tricarbónico, de forma similar a la observada anteriormente en E. coli.
Una pregunta interesante es si las perturbaciones pueden tener un efecto positivo en un proceso a gran escala. Otros investigadores descubrieron recientemente que una proteína heteróloga (fosfatasa alcalina), que se expresa como un producto periplásmico en E. coli, se produce a niveles más altos con un perfil de alimentación cíclica.
Curiosamente, en otro estudio, los autores descubrieron que se libera más producto en el medio de cultivo (aumento del 60 %) en cultivos con perturbaciones cíclicas en comparación con condiciones bien mezcladas y homogéneas.
Como procedimiento óptimo final, los autores proponen un perfil de alimentación triangular, que se aplica después de la inducción. Estos resultados son hasta ahora una excepción.
En la mayoría de los casos, el rendimiento de un producto recombinante disminuye significativamente por la exposición del cultivo a condiciones no homogéneas.
Esto se ha observado para una variante inestable de la proteína A, donde el menor rendimiento se relacionó con una mayor actividad proteolítica.
La alimentación cíclica de glucosa en condiciones completamente aeróbicas resultó en una alta inestabilidad proteolítica de la 𝛼-glucosidasa de levadura expresada heterólogamente en E. coli.
El ciclo entre condiciones aeróbicas y anaeróbicas conduce a una disminución significativa del rendimiento de insulina recombinante, como lo demuestra un estudio con diferentes tiempos de circulación en un sistema STR-STR de dos compartimentos.
Uno de los microorganismos industriales más importantes es C. glutamicum.
Sorprendentemente, las primeras investigaciones sobre la robustez de C. glutamicum en condiciones a gran escala consideran el desarrollo de un biorreactor especial de escala reducida con un tiempo de mezcla más prolongado (Θ90 = 130 s frente a 10 s), que se seleccionó teniendo en cuenta la entrada de potencia específica (P/V) de un reactor de producción de 10 m3.
Este aumento del tiempo de mezclado se logró implementando cinco discos fijos entre seis turbinas Rushton.
Como resultado, los cultivos en este reactor de escala reducida mostraron un crecimiento reducido (-7 %) relacionado con un menor consumo de azúcar y amoníaco y una menor producción de lisina (-12 %). Sin embargo, C. glutamicum parece ser relativamente robusta.
Ni el estrés mecánico extremo ni la alta aireación o las bajas concentraciones de oxígeno disuelto causaron una respuesta fisiológica significativa.
Esta elevada robustez de C. glutamicum, que podría ser una de las razones de su extraordinario éxito industrial, también fue confirmada por los estudios realizados por Käß et al.
Estudiaron el impacto de la zona de alimentación (acceso de glucosa concomitante y limitación de oxígeno) en un sistema de reactor de dos compartimentos que consiste en un STR aireado acoplado a un módulo PFR no aireado.
Los autores aplicaron diferentes cepas, una cepa de tipo salvaje y una superproductora de lisina, y diferentes tiempos de residencia en el módulo PFR de hasta 3 min.
Curiosamente, solo se encontraron diferencias en la acumulación de lactato, pero no hubo reducción del rendimiento del crecimiento ni pérdidas de productividad.
Recientemente, se realizaron cultivos en reactores de dos y tres compartimentos con C. glutamicum y se compararon con un cultivo STR estándar.
Mientras que el STR estaba aireado, los dos PFR acoplados no estaban aireados: uno con adición de alimento y el segundo sin él.
Los resultados mostraron que el lactato y el succinato, así como una serie de aminoácidos (glicina, treonina, glutamato, glutamina), que se derivan del metabolismo central del carbono, se acumularon hasta el doble en el cultivo del reactor de tres compartimentos que en el de dos. cultivo en reactor compartimental.
En contraste con el cultivo en reactor de dos compartimentos, no se observa acumulación intracelular de piruvato en el cultivo en reactor de tres compartimentos, ya que los flujos de carbono se dirigen hacia el lactato.
Esta adaptación de las células, que puede considerarse exitosa, se revela mediante un análisis de citometría de flujo de células teñidas con BOX y una serie de mediciones electroópticas en línea de la polarizabilidad celular.
Ambos métodos indican una mayor polarizabilidad de las células en el cultivo del reactor de tres compartimentos.
La tinción con PI no indica ningún daño significativo en la membrana ni muerte celular acelerada en ninguno de los sistemas.
Sin embargo, aunque la cepa muestra robustez, el rendimiento del producto de lisina se redujo en cultivos reducidos, lo que subraya la importancia de la optimización del proceso.
Recientemente, Buchholz investigó el efecto de los niveles oscilantes de CO2/HCO3 en un biorreactor en cascada de tres compartimentos sobre el rendimiento de biomasa, así como el metaboloma y la respuesta transcripcional de una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum y un productor de lisina.
El tiempo de residencia en el ambiente elevado de CO2/HCO3 se ajustó a 3,6 min a una relación de volumen de 8,4%, lo que pareció ser relevante para la escala de producción industrial.
Se aplicaron gradientes de presión de pCO2 de 75-315 mbar.
Aunque más de 60 genes se regularon hacia arriba o hacia abajo en estas condiciones según el gradiente de presión y el tiempo de residencia, no se encontraron cambios notables en la concentración de biomasa y producto en comparación con el cultivo de referencia.
Estos hallazgos interesantes indican no solo una fuerte respuesta a la disponibilidad oscilante de CO2, sino también una alta robustez de C. glutamicum, aunque quedan por resolver los mecanismos detallados.