Proteínas recombinantes y la operación de un biorreactor.

A priori, se pueden considerar tres modos operativos para la producción de proteínas recombinantes, a saber, cultivo discontinuo, discontinuo y continuo en la operación de un biorreactor.

Para la viabilidad económica, cualquier método de cultivo tiene que cumplir con varios criterios, incluyendo alta productividad volumétrica, alta concentración de producto final, estabilidad y reproducibilidad del proceso, sustratos de bajo costo (en el caso de proteínas a granel), así como restricciones legales, para, por ejemplo, los relacionados con la aplicación de tecnología de ADN recombinante.

Los cultivos por lotes generalmente no son adecuados para la producción a gran escala. La alta concentración de sustrato (azúcar) al inicio del cultivo provoca fenómenos de represión de catabolitos. Además, la sensibilidad osmótica de las células (o la toxicidad del sustrato, por ejemplo, cuando se usa metanol como fuente de carbono en sistemas de levadura metilotrófica) impone un límite a la concentración inicial de nutrientes. Además, dado que no se puede controlar la tasa de crecimiento, el cultivo por lotes se ve limitado por el oxígeno en la operación de un biorreactor. Las altas tasas de crecimiento también pueden causar un metabolismo de desbordamiento, lo que lleva a la formación de subproductos, incluso en presencia de oxígeno; por ejemplo, la fermentación alcohólica se desencadena en algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae, la formación de acetato en Escherichia coli o la excreción de lactato y amonio en cultivos de células de mamíferos en la operación de un biorreactor. Además, el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de subproductos conducen a la apoptosis (muerte celular programada) en los sistemas celulares de los mamíferos. Por el contrario, la tasa de crecimiento en cultivos continuos y en lotes alimentados se puede modular mediante la adición controlada de sustrato, evitando así la formación de subproductos y los fenómenos de represión de catabolitos enla operación de un biorreactor, además de permitir la adaptación de la absorción de oxígeno y la generación de calor al rendimiento del biorreactor. Sin embargo, los cultivos continuos prolongados pueden dar como resultado la acumulación de poblaciones de células menos productivas o no productivas y, por lo tanto, una disminución de la productividad.

Como resultado, el cultivo por lotes alimentado es a menudo el modo operativo preferido para la producción a gran escala de proteínas heterólogas. En particular, los procesos de alimentación por lotes se realizan típicamente a una tasa de crecimiento baja cuando se operan en condiciones que limitan el sustrato. Por lo tanto, los efectos de una tasa de crecimiento bajan sobre la fisiología celular y las tasas de formación de productos de las células son de importancia clave y tienen un gran impacto en la productividad específica. Por ejemplo, se pueden provocar respuestas celulares como la falta de nutrientes, contribuyendo así al estrés metabólico de las células huésped. Estudios transcriptómicos recientes en levaduras han revelado que la tasa de crecimiento regula procesos centrales como la síntesis y secreción de proteínas, así como la respuesta al estrés. En particular, una parte sustancial del carbono del sustrato se gasta para satisfacer los requisitos de energía de mantenimiento en condiciones que limitan el crecimiento, como las que se encuentran en los procesos de alimentación por lotes. Los altos requisitos de mantenimiento van a expensas de la biomasa y la formación de productos y, por lo tanto, no son deseables en la producción de proteínas heterólogas. Los requisitos de mantenimiento pueden verse significativamente influenciados por parámetros ambientales como la temperatura, el pH y la composición del medio.

Además, los procesos de producción de proteínas recombinantes se llevan a cabo normalmente en cultivos de alta densidad celular (HCDC) para maximizar los rendimientos espacio-temporales y las productividades volumétricas. En HCDC, las células a menudo sufren varios desafíos fisiológicos, incluida la disponibilidad limitada de oxígeno, la acumulación de dióxido de carbono a niveles que pueden disminuir la tasa de crecimiento y estimular la formación de subproductos (por ejemplo, acetato en E. coli), la generación de calor y la eficiencia de mezcla reducida. Tales tensiones ambientales en HCDC de lotes alimentados no ocurren simplemente como respuestas transitorias a cambios repentinos (choque), sino más bien como una adaptación a largo plazo de las células productoras a condiciones subóptimas. De hecho, las células están expuestas a una limitación de energía progresivamente creciente, experimentando una mayor muerte y lisis celular, segregación en estados viables, pero no cultivables y perfiles transcripcionales alterados a altas densidades celulares. Por lo tanto, la inducción de la expresión de proteínas recombinantes bajo estas condiciones de estrés «basal» impone un estrés intrínseco adicional superpuesto al sistema.

Una complicación adicional en huéspedes procarióticos como E. coli son los mecanismos de detección de quórum, es decir, los sistemas de señalización intercelular reguladores del crecimiento en los que una molécula de señal extracelular soluble que, al alcanzar una concentración crítica en el medio, permite la activación sincrónica de la respuesta a nivel de población, por ejemplo, en respuesta a un estrés ambiental o limitación de nutrientes. DeLisa y col. demostraron que E. coli comunica el estrés o la carga impuesta por la acumulación de proteína heteróloga. Se han descrito varios mecanismos similares a la detección de quórum en levaduras. Sin embargo, aún se desconoce cómo estos mecanismos pueden interferir con la producción de proteínas en estos microorganismos.