Alimentación por lotes y operación continua de micro-biorreactores

Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Ambos modos de operación se utilizan para superar la inhibición del sustrato, la represión catabólica o el metabolismo de desbordamiento. El suministro limitado de sustrato es adecuado para evitar la limitación de oxígeno a altas densidades celulares. Además, las condiciones óptimas para el crecimiento y la formación del producto se pueden ajustar mediante la aplicación apropiada del modo de operación de alimentación por lotes. Finalmente, un problema a menudo subestimado en la detección es el crecimiento no paralelo de cultivos discontinuos debido a un protocolo de tiempo fijo. Los modos de operación de alimentación por lotes son adecuados para igualar el crecimiento en precultivos y, posteriormente, para asegurar la misma condición de cultivo inicial para los microorganismos en los cultivos principales. A diferencia de las condiciones de los lotes alimentados en los procesos de producción, los experimentos de selección en microbiorreactores se realizan comúnmente en modo de lotes. La diferencia fundamental entre ambos modos de funcionamiento puede llevar a una selección errónea de las deformaciones. Como consecuencia, las modificaciones del proceso pueden llegar a ser necesarias en un momento posterior y el desarrollo del proceso será menos eficiente. Para superar este problema, actualmente se desarrollan e investigan sistemas de detección de lotes alimentados.

Alimentación controlada por difusión del microbiorreactor

Una forma técnicamente simple y rentable de proporcionar condiciones de cultivo de lotes alimentados en pequeña escala es la liberación controlada de difusión de sustratos en el caldo de cultivo. La ventaja de los sistemas impulsados por difusión es que no se necesitan equipos técnicos adicionales, como bombas y válvulas. Este enfoque es aplicable a cualquier valor de pH.  Jeude y otros investigadores presentaron una técnica de selección paralela para microbiorreactores basados en discos de elastómeros que se cargaron con glucosa. La glucosa sólida se incrusta en una matriz de silicona y el disco de polímero se agrega al caldo de cultivo. Si el agua se difunde en la matriz de silicona, la glucosa disuelta se difunde fuera del elastómero de silicona y el sustrato se libera en el caldo de cultivo. La liberación del sustrato se ajusta por la concentración del sustrato en el elastómero, las propiedades de la silicona y la geometría del disco. Este sistema se aplicó con éxito en matraces de agitación y placas de microtitulación. Se demostró que el metabolismo de desbordamiento de Hansenula polymorpha podía reducirse y se alcanzó un aumento del rendimiento de biomasa del 85%. Además, la formación de GFP aumentó 35 veces en el medio mineral Syn6-MES e incluso 420 veces en el medio mineral YNB en comparación con los cultivos discontinuos con la misma cantidad de glucosa totalmente metabolizada. Se utiliza un diseño ligeramente diferente de este sistema de alimentación en placas de 96 pocillos, en las cuales la matriz de silicona se fija en el fondo de cada pozo. Con ese sistema se han llevado a cabo exitosos cultivos de H. polymorpha en lotes alimentados. En lugar de glucosa, Scheidle encapsuló carbonato de sodio Na2CO3 en la matriz de silicona para controlar el valor de pH en cultivos de E. coli en matraces de agitación. Además, otros sustratos sólidos se pueden incrustar en la matriz de elastómero.  Sin embargo, los líquidos, como por ejemplo el glicerol, no pueden ser alimentados. Un enfoque técnico similar para la alimentación de sustratos fue utilizado por Hegde. Los discos de hidrogel, hechos de hidrogel de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), se cargaron con glucosa e hidrolizado de proteínas para el cultivo alimentado por lotes de células CHO en matraces de agitación.

Bähr presentó un enfoque técnico diferente para la liberación de sustratos controlada por difusión. Este sistema de biorreactores consiste en un matraz de agitación para diálisis, compuesto por un matraz Erlenmeyer convencional y un depósito de sustrato tubular central. El depósito de sustrato se coloca en el centro del tapón de rosca. Al final, el depósito de sustrato se sella con una membrana fijada en una punta. La membrana gira sincrónicamente con el líquido dentro del matraz durante la agitación, y por lo tanto, se asegura el contacto permanente entre la membrana y el líquido. La alimentación de líquidos y sustratos sólidos disueltos es posible con ese sistema. La velocidad de difusión del sustrato se puede ajustar por la concentración de alimentación del sustrato y la geometría y las propiedades de la membrana. Otro sistema de alimentación impulsado por difusión es la placa de microtitulación de alimentación por lotes desarrollada recientemente. En esa placa de microtitulación, la mitad de los pozos sirven como depósitos de sustrato, mientras que la otra mitad sirve como pozos de cultivo. Un depósito de sustrato está conectado a un pozo de cultivo a través de un canal de hidrogel. Se utiliza una placa inferior especial con canales, en la que se llena el hidrogel. El sustrato se difunde desde el depósito de sustrato hacia el canal de hidrogel y, además, hacia el pozo de cultivo. La velocidad de difusión depende de la concentración de alimentación del sustrato, la geometría del canal y las propiedades del hidrogel. Una ventaja de este sistema  es que el tiempo, que necesitan las moléculas de sustrato para pasar el hidrogel, se puede ajustar mediante la elección adecuada de la longitud del canal. De este modo, se puede definir el momento en que comienza la alimentación del sustrato de los microorganismos. Este sistema de alimentación, aplicable para casi cualquier sustrato, fue probado con éxito en cultivos de E. coli y H. polymorpha.