- Diseño de experimentos y biorreactores (DoE)
- Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores
- Evaluación del Diseño Experimental en biorreactores.
- Diseño de experimentos de cribado en biorreactores
- Diseño de experimentos de biorreactores para el desarrollo y optimización de medios .
Desafíos más severos durante la ampliación de biorreactores
Hasta ahora, la ampliación de biorreactores se suele realizar mediante un conjunto de experimentos elegidos al azar, que se realiza de acuerdo con la infraestructura disponible.
Rara vez se realiza sobre la base de modelos matemáticos, que describen el comportamiento a gran escala de un proceso basado en experimentos a escala de laboratorio (y probablemente enfoques de reducción de escala adecuados, que se realizaron con anticipación).
Estos enfoques empíricos evolucionan de manera iterativa y se basan en gran medida en las experiencias de los desarrolladores.
Si se logra un cierto grado de reproducibilidad en biorreactores y tanques entre la escala piloto y la de producción, la ampliación generalmente se considera exitosa.
La falta de datos dentro de la comunidad científica sobre los rendimientos de la ampliación de biorreactores y la propia escala industrial dificulta un enfoque científico detallado.
Dado que solo se dispone de datos muy limitados, muchos enfoques no pudieron evaluarse para varios casos.
Naturalmente, los modelos disponibles, que intentan predecir el comportamiento a gran escala, solo pueden ser tan buenos como los datos (en cantidad y calidad) en los que se basan.
Se necesitan mayores esfuerzos para compartir datos entre la industria y la ciencia cuando se deben lograr avances. Un ejemplo es la evolución de modelos de flujo de fluidos refinados y, por lo tanto, mejorados.
Si bien los modelos básicos ya se derivaron hace una década, la alta resolución será factible solo si se pueden obtener suficientes datos de la distribución de sustrato, oxígeno y dióxido de carbono, incluida la burbuja de gas y el tamaño de la celda, mediante métodos de monitoreo adecuados.
Las diferencias de los números de Reynolds a una entrada de energía y una velocidad del agitador similares en diferentes escalas conducen a variaciones en la transferencia de masa y calor.
Sin embargo, las grandes diferencias debidas a las diversas aplicaciones biotecnológicas son aún de mayor importancia.
Por ejemplo, un cultivo de hongos necesita un desarrollo de parámetros de ingeniería tradicionales que es diferente de un cultivo bacteriano debido a los cambios de viscosidad.
Por lo tanto, el conocimiento limitado sobre el comportamiento a gran escala a menudo no es transferible de una investigación a otra.
Los problemas de los diferentes comportamientos de las células a gran escala debido a las faltas de homogeneidad en la fase líquida están contrarrestando los beneficios del aumento de escala.
Cualquier mejora se basa en la definición correcta de las condiciones a gran escala para simular adecuadamente estas condiciones en una escala más pequeña como un enfoque iterativo que se basa en principios de calidad por diseño y optimización de procesos basada en modelos en combinación con ingeniería de tensión.
Es necesario superar la falta de datos para hacer frente a los problemas actuales de ampliación mediante el diseño de sistemas de reducción más adecuados.
Un conjunto adecuado de modelos basados en datos relevantes es un requisito previo para lograr este objetivo.
Consideración de similitudes y números adimensionales en biorreactores
Para determinar los parámetros cruciales del proceso, los números adimensionales en biorreatores proporcionan una estimación útil de la similitud entre diferentes escalas.
Básicamente, las proporciones volumétricas de los parámetros clave se mantienen bastante constantes, si los números adimensionales en biorreactores se mantienen durante el aumento de escala.
Oosterhuis describió la disponibilidad de oxígeno disuelto como un componente limitante en la producción de ácido glucónico en una escala de 25m3, ya que se supuso que los tiempos de circulación y transferencia de masa de oxígeno eran críticos, siendo el primero inferior a la OUR del cultivo.
Dado que el tiempo de mezcla es el parámetro más crucial durante el aumento de escala de los procesos aeróbicos por lotes alimentados, se realizaron numerosos experimentos a gran escala para confirmar el aumento estimado en el tiempo de mezcla a escala de laboratorio.
Una de las razones del aumento típico en el tiempo de mezclado a gran escala de los números adimensionales en biorreactores es el requisito de entrada de energía adicional. Aumenta en 2/3 la potencia de aumento del volumen del líquido.
Por lo general, la entrada de energía se reduce durante la ampliación a escala de producción industrial.
Los factores químicos también afectan el aumento de escala, ya que es la presión parcial de los gases en la parte inferior (p. ej., dióxido de carbono disuelto) y la formación de espuma en la parte superior.
Aunque ambos casos no se pueden eludir a gran escala, ya que resultan del aumento del volumen de líquido, el diseño del proceso y la ingeniería de deformaciones se pueden enfocar para abordar estos problemas típicos de la escala industrial.
Tasa de corte
Dado que la velocidad de la punta del agitador en un tanque de acero inoxidable aumenta a gran escala para limitar la reducción de la entrada de energía volumétrica durante el aumento de escala, las tasas de cizallamiento también aumentan cerca de los agitadores.
Como consecuencia, el gradiente entre las fuerzas de cizallamiento lejos de los agitadores y las que están en la punta de los agitadores es comparativamente grande a escala industrial.
Sin embargo, el mantenimiento de la velocidad de cizallamiento es especialmente importante para las células sensibles al cizallamiento, como las líneas celulares.
Por lo tanto, representa un criterio de escalado adecuado para este tipo de cultivos.
Fisiología celular
Dado que el enfoque de la ingeniería clásica para la ampliación no siempre es factible, varios estudios propusieron que un análisis adimensional clásico podría no ser suficiente para la descripción de la ampliación y, en consecuencia, la reducción de los procesos biotecnológicos, ya que – a diferencia de los procesos químicos – el comportamiento celular juega un papel importante en el éxito de la producción industrial.
Por lo tanto, los autores proponen que se agregue un análisis mecanicista al análisis adimensional, que considere parámetros del metabolismo celular y el estado fisiológico.
En conjunto, un análisis de régimen de ambos conjuntos de parámetros se considera un enfoque adecuado para un análisis de proceso general. Votruba y Sobotka afirman que la transferencia de tecnología microbiana del laboratorio al nivel de producción industrial se ve críticamente afectada, a diferencia de los reactores químicos, por la fisiología del crecimiento y la producción, es decir, por la relación entre la capacidad de producción potencial de los microorganismos seleccionados y las condiciones externas en el biorreactor.
Dado que las restricciones de la transferencia de masa de gas, los gradientes de suministro de nutrientes, el valor de pH y otros parámetros del proceso pueden afectar directamente el estado fisiológico de la célula, lo más probable es que un estado similar esté relacionado con condiciones de cultivo muy similares.
Como consecuencia, el escalado de un bioproceso debe incluir un análisis adecuado del estado fisiológico, eventualmente por medio de las posibilidades actualmente en aumento para aplicar sensores en línea.
Permiten lograr una alta resolución de imágenes fisiológicas y morfológicas de un cultivo o incluso de células individuales en una alta resolución de tiempo.
Se puede lograr una cantidad y calidad de datos similar a la de los parámetros de ingeniería tradicionales.
Escalado de biorreactores
El escalado de biorreactores a menudo enfrenta problemas debido a las restricciones en el mantenimiento de los parámetros clave del proceso, que no pueden mantenerse constantes por razones mecánicas y económicas.
Sin embargo, una consideración de la tasa de cambio de estos parámetros desde el laboratorio hasta la escala industrial permite una estimación del cambio del grado de homogeneidad al que están expuestas las células.
Como regla general, la relación potencia-volumen P/V y el coeficiente de transferencia de masa de oxígeno kLa se aplican al 30 % como el criterio de aumento de escala dominante en la industria.
Por lo tanto, el objetivo es mantener estos parámetros lo más constantes posible entre las diferentes escalas. Sin embargo, la igualdad de la velocidad del flujo del fluido descrita por el número de Reynolds explicaría un aumento de la relación de entrada de energía volumétrica (P/V) de 105 de 10 l a 10 m3, que está muy por encima de lo que generalmente se alcanza en Gran escala.
El reactor de tanque agitado convencional es el sistema para el que se han establecido la mayoría de las correlaciones y se ha llevado a cabo una intensa investigación sobre los fenómenos de aumento de escala.
Por lo tanto, este diseño de reactor es comparablemente fácil de describir con los enfoques de ingeniería clásica en cualquier escala, lo cual es una ventaja para las versiones de un solo uso desarrolladas recientemente de estos tipos de biorreactores.
Sin embargo, el aumento de escala también se describe en el mismo conjunto de parámetros de proceso para biorreactores agitados, por ejemplo, agitadores orbitales de un solo uso.
Se han realizado estudios de ampliación para varios otros diseños de biorreactores, pero generalmente están restringidos a ciertas restricciones mecánicas o limitaciones técnicas.
Estos parámetros se utilizan para estimar las diferencias de las condiciones del proceso en las diferentes escalas.
Dependiendo de la escala, en el escalado de biorreactores, el tipo de microorganismo, el modo de proceso y las características del sustrato y el producto, se consideran otros parámetros adicionales, por ejemplo, la viscosidad si se produjeran sustancias poliméricas.
La transferencia de oxígeno en el escalado de biorreactores es el parámetro más importante que debe mantenerse en un rango suficiente durante el escalado.
La concentración de oxígeno disuelto en una suspensión de microorganismos aerobios depende de la tasa de transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a la líquida, de la tasa a la que se transporta el oxígeno al medio y de la OUR del microorganismo para su crecimiento, mantenimiento y producción.
El transporte del gas a la fase líquida depende en gran medida del área de superficie gas-líquido, que aumenta debido a la dispersión por los agitadores.
Se han realizado muchos intentos para estimar el valor de kLa mediante ecuaciones empíricas para cualquier propósito y diseño de reactor, independientemente de la escala.
Se han realizado varias revisiones exhaustivas que resumen las estimaciones del valor kLa para diferentes tasas de gasificación, geometrías de biorreactores y viscosidades de líquidos en función de la potencia de entrada y la velocidad del agitador, por ejemplo.
Relevante para el logro de una concentración suficiente de oxígeno disuelto a gran escala es la relación entre la potencia de entrada volumétrica P/V y el valor de kLa.
De hecho, durante los procesos de escalado desde la escala del multibiorreactor (típicamente entre el rango de microlitros y mililitros) hasta los procesos a escala de laboratorio, el mantenimiento del valor kLa se identificó como lo más importante para lograr el mayor grado de similitud.
Estos resultados se obtuvieron cuando el valor kLa se consideró como factor de aumento de escala en comparación con la potencia de gasificación a volumen (Q/V) y la relación potencia a volumen (P/V) en un estudio de aumento de escala de 100 ml a 2 l de volumen de trabajo.
Mientras mantienen un valor de kLa constante, Alam et al. descubrió un factor de escala para la velocidad de agitación y el caudal de aire de 0,28 y 3,1, cuando se compararon las dos escalas de 16 y 150 l de volumen de trabajo.
La reducción en la velocidad del agitador podría contrarrestarse con un mayor apoyo de energía debido a la mayor tasa de gasificación.
Ju et al. propuso reemplazar el criterio de aumento de escala de un valor kLa constante por la tasa de transferencia de oxígeno a un valor predeterminado de oxígeno disuelto.
Puede mantenerse aplicando diferentes presiones parciales de oxígeno en las corrientes de gas entrantes para diferentes escalas. Sin embargo, el logro de varias presiones parciales de oxígeno en fase gaseosa puede ser difícil en procesos a gran escala.
Otro parámetro importante que afecta el valor de kLa es la tasa de disipación de energía local cerca del agitador.
El gradiente entre las zonas cerca de la punta de una turbina Rushton y en las zonas entre los agitadores aumenta en un volumen de trabajo mayor.
Un buen indicador es la relación entre la disipación de energía específica local y la media.
La reducción de esta relación conduce seguramente a una menor falta de homogeneidad en la fase líquida.
Gradientes de biorreactores biorreactor.
Los avances en modelos metabólicos, que se han desarrollado sobre la base de experimentos de pulso en cultivos de quimiostatos, por ejemplo, por Reuss et al. para levadura y E. coli en el contexto de la biología de sistemas, y el comportamiento de respuesta de las células descrito por estos modelos se combinaron con modelos dinámicos de fluidos para reflejar y estimar gradientes en cada parte de un biorreactor.
Actualmente, con respecto a los enfoques de calidad por diseño, se abordan varias cuestiones con conceptos de investigación de escala reducida:
1) Los desarrollos están impulsados por el interés en simular condiciones oscilantes que ya se encuentran en la etapa de selección de nuevas cepas. Actualmente se están desarrollando nuevas técnicas para lograr perturbaciones en placas de micropocillos. Esto es un desafío ya que dichos enfoques deben realizarse en condiciones de limitación de nutrientes, es decir, mediante la aplicación de la tecnología de alimentación por lotes. Los desarrollos recientes, como las microválvulas que se acoplan con micropocillos o sistemas de alimentación basados en biocatalizadores, hacen factibles estos estudios. Las respuestas de los microorganismos a las oscilaciones se investigan en relación con el desarrollo de poblaciones a nivel unicelular. Los nuevos microsistemas permiten seguir tales desarrollos en tiempo real.
2) Los análisis de células individuales se benefician de los sistemas de indicadores de genes basados en fluorescencia, que proporcionan una nueva perspectiva de la cinética temporal de las respuestas celulares con una resolución sobre la población. Cada vez más herramientas en línea se encuentran en etapa de desarrollo y serán aplicables en los próximos años. La combinación con herramientas en línea que permiten seguir la fisiología y la morfología de células individuales permite utilizar parámetros de ingeniería distintos de los clásicos para diseñar experimentos a escala reducida. Una condición celular similar sería una prueba de que el entorno circundante es probablemente idéntico en las diferentes escalas.
3) El impacto de factores ambientales perturbadores adicionales en gradientes de biorreactores a gran escala, en la fisiología celular y la heterogeneidad de la población, y los sistemas de reducción de escala adaptados concomitantemente para su investigación, por ejemplo, para la consideración de las concentraciones de dióxido de carbono.
4) Un análisis más profundo de la red metabólica y la determinación del flujo aumentarán la comprensión general de la respuesta celular dentro de la red reguladora integral en las perturbaciones.
5) Se necesitan diseños de reactores de escala reducida a medida, debido al hecho de que el flujo de fluido y las condiciones de mezcla varían, ya que básicamente no existe un diseño de gradientes de biorreactores estándar, incluida la ubicación de la adición de alimentación, para ningún tipo de proceso. Para un artículo reciente, véase Lemoine et al. quien realizó estudios en un biorreactor de escala reducida de tres compartimentos, que constaba de dos reactores de flujo pistón basados en un caso industrial. El reactor representa un paso más en el desarrollo de un reactor de dos compartimentos, que constaba únicamente de piezas disponibles en el mercado, y permitió el monitoreo y el muestreo en cinco posiciones a lo largo de la altura de un módulo de flujo pistón de 4 m de largo. Este módulo estaba equipado con mezcladores estáticos y tenía un volumen del 15% del volumen total de líquido.
6) Para un diseño a escala apropiado, se necesitan nuevas herramientas para caracterizar los gradientes de biorreactores a gran escala. Los primeros enfoques con sensores móviles y sistemas de muestreo se han probado en procesos de biogás, pero también se puede esperar su aplicación en otros bioprocesos.
7) Es necesario realizar estudios de las respuestas microbianas al entorno a gran escala con una gama más amplia de microorganismos. El interés continuo en aumentar constantemente los volúmenes de los reactores en la industria biotecnológica, por un lado, y la presión de los costos de los productos, por otro lado, aumentan la relevancia de la comprensión y el manejo de los efectos a gran escala. Recientemente, por ejemplo, está aumentando la cantidad de artículos que estudian los efectos a gran escala de Corynebacterium glutamicum, uno de los microorganismos más importantes en vista de la cantidad de productos y la escala.
Sistemas basados en dinámica de fluidos computacional en biorreactores.
Las observaciones básicas de que los microorganismos responden a las perturbaciones cíclicas y los estudios cinéticos de las respuestas microbianas a pulsos individuales provocaron el desarrollo de nuevos sistemas de reducción de escala.
Las interacciones entre la dinámica de fluidos computacional en biorreactores a escala industrial y la biocinética transitoria se convirtieron en el foco de la investigación.
Los avances se originaron inicialmente a partir de una red europea nórdica más grande basada en el apoyo del Fondo Industrial Nórdico, que se dirigió al «Desarrollo de métodos para estudiar el rendimiento y las características de los biorreactores» (1991–1993).
Las actividades interdisciplinares de grupos de Suecia, Noruega y Dinamarca se centraron en la aplicación de la dinámica de fluidos computacional en biorreactores (CFD), basada en el análisis de biorreactores a escala industrial y el desarrollo de sistemas de reducción de escala.
Las actividades incluyeron mediciones exhaustivas en un biorreactor de tanque agitado de 30 m3 en Statoil (Stavanger, Noruega) y en una columna de burbujeo de 200 m3 en Jästbolaget (Estocolmo, Suecia).
Los resultados de dinámica de fluidos computacional en biorreactores, con las fermentaciones con Saccharomyces cerevisiae como ejemplo, demostraron que existen gradientes de glucosa en grandes biorreactores de tanque agitado y proporcionaron un mejor conocimiento sobre el tamaño de estos gradientes.
Los datos también mostraron que la decisión de utilizar una alimentación desde arriba o desde abajo tiene un gran impacto en el perfil de glucosa en el biorreactor.
Los autores aplicaron una técnica de muestreo rápido por primera vez y demostraron que las zonas con mayor concentración de glucosa se mueven a través del biorreactor.
La variación local de la concentración de glucosa dependía de la turbulencia dentro de la zona en la que se añadía el pienso y de la distancia entre el punto de muestreo y la adición del pienso.
El interés por estudiar la cinética de la reacción microbiana en una zona de alimentación provocó el desarrollo de sistemas especiales de reducción de escala.
El concepto de reactor de dos compartimentos se modificó aún más para que incluyera un elemento mezclador estático en el circuito de tanque de acero inoxidable.
Esto permitió lograr una cierta transferencia de masa de gas respaldada por aireación directa en el circuito y mantener el flujo de pistón al mismo tiempo.
El reactor se utilizó para separar los efectos de la alta concentración de glucosa (zona de alimentación) y la limitación de oxígeno, que sería el resultado de la alta actividad metabólica en esta zona.
Los examinadores lograron mantener las condiciones aeróbicas en la entrada del bucle con una adición continua de oxígeno puro. En este caso, la producción de etanol estaba simplemente relacionada con la mayor concentración de glucosa.
El mismo sistema fue aplicado por Neubauer et al. para estudiar el metabolismo de desbordamiento de acetato en una zona de PFR aeróbica.
Los autores también compararon los cultivos con el suministro de aire enriquecido y no enriquecido con oxígeno en el PFR a los cultivos.
Mientras se utilizaba el bucle PFR como zona de inanición al alimentar la glucosa al compartimento STR, se demostró que la inanición de corta duración induce cíclicamente el tetrafosfato de guanosina regulador de respuesta estricta (ppGpp), es decir, E. coli responde a la inanición cíclica como puede ocurrir en partes más grandes de biorreactores a gran escala.
Los resultados del proyecto nórdico antes mencionado fueron la base para un enfoque interdisciplinario más amplio dentro del programa Marco 4 sobre «Estrategia de ampliación de bioprocesos basada en la integración de la fisiología microbiana y la dinámica de fluidos computacional en biorreactores «.
Este proyecto, que se basó en cultivos de E. coli, incluyó un análisis detallado de las reacciones metabólicas en el sistema de biorreactor de dos compartimentos.
Los resultados indicaron que E. coli responde con la inducción de un metabolismo típico de fermentación ácida mixta cuando las células se exponen a pulsos de glucosa de corta duración y la limitación de oxígeno concomitante.
Esta respuesta anaeróbica se observó más claramente en E. coli en comparación con los cultivos de levadura, porque la constante de afinidad por la glucosa (ks) es un orden de magnitud más baja en E. coli, lo que implica una concentración media de sustrato más baja durante las condiciones de alimentación por lotes con glucosa limitada.
Los cultivos con E. coli en la escala de 22 m3, que se habían aplicado previamente para levadura, mostraron que la variación local de glucosa era mayor y los efectos de gradiente más pronunciados.
Lo que es más importante, la cinética microbiana no solo se estudió en relación con los perfiles metabólicos de productos finales clave del metabolismo del carbono, sino también con análisis cuantitativos de ARNm para una serie de genes marcadores.
Schweder et al. demostraron una respuesta a nivel transcriptómico.
Los ARNm relacionados con el estrés aumentaron dentro de la residencia de las células en el bucle PFR. Además, se detectó expresión génica diferencial para estos genes a gran escala.
Mezcla y Distribución Espacial en Biorreactores.
Durante estos primeros estudios, se investigaron los conceptos básicos de los fenómenos de mezcla y distribución espacial en biorreactores. Oosterhuis y Kossen caracterizaron el impacto en diferentes parámetros de ingeniería, como la entrada de energía, la transferencia de oxígeno mediante un modelo de dos compartimentos y un modelo de cinco compartimentos para efectos de escalado, respectivamente.
Este último mostró claramente que la tasa de transferencia de oxígeno difiere en varias partes de un reactor. Se proporcionaron datos sobre la dependencia de la tasa de transferencia de oxígeno, la retención de gas y la velocidad del agitador. La circulación del líquido y el tiempo de mezcla se determinaron con una radiopíldora en el mismo biorreactor de 19 m3 en un estudio posterior.
La circulación del líquido y el tiempo de mezcla se determinaron con una radiopíldora en el mismo biorreactor de 19 m3 en un estudio posterior. A partir de los experimentos, que se realizaron en agua, se desarrolló un primer modelo que describía la circulación del líquido por diferentes compartimentos del biorreactor.
El tiempo de circulación estuvo fuertemente influenciado por la tasa de aireación y difería en varias regiones del biorreactor. Estos estudios proporcionaron una buena base experimental y teórica de que los microorganismos en cultivos a gran escala podrían estar expuestos a condiciones ambientales cambiantes. Paralelamente, Sweere et al. realizaron experimentos a pequeña escala, a los que se les aplicaron oscilaciones de oxígeno.
Proporcionaron evidencia de mezcla y distribución espacial en biorreactores de que los microorganismos responden a tales fluctuaciones con la levadura como ejemplo. Estos estudios también proporcionaron los primeros datos sobre la respuesta de la levadura en función de la duración del ciclo, es decir, el intervalo de tiempo de las fluctuaciones para la producción de biomasa y varios metabolitos (etanol, ácido acético, glicerol).
Se observaron distintas respuestas cuando las fases de limitación de oxígeno duraron más de 7,5 s con un tiempo de ciclo total de 30 a 60 s. Swere et al. estudiaron los efectos de una zona de alimentación de glucosa en el metabolismo de la levadura en un simulador a pequeña escala.
Por lo tanto, se utilizó un sistema de dos compartimentos que constaba de dos reactores de tanque de acero agitado. Los autores examinaron la respuesta en varios tiempos de circulación.
Ya un tiempo de circulación de 1 min redujo el rendimiento de biomasa en un 10% y mostró claramente la acumulación de etanol. Estos estudios provocaron la conclusión de que la cinética de respuesta y relajación del sistema biológico sería un parámetro clave para describir el comportamiento del proceso.
Un importante estudio, de mezcla y distribución espacial en biorreactores, de esa época descrito por Vardar y Lilly mostró que las concentraciones de oxígeno en ciclos reducen la tasa de formación del producto de penicilina en Penicillium sp. cultivos.
Si la tasa de respiración se reduce al 90% del valor máximo, no se forma ningún producto. Los autores demostraron que las oscilaciones de la tensión de oxígeno disuelto en torno al valor crítico y la falta de oxígeno durante 16 min dieron como resultado una reducción irreversible de la tasa de consumo de oxígeno (OUR) y la producción de penicilina.
Estos estudios implicaron estudios fisiológicos detallados, que investigaron el efecto de las adiciones discontinuas o cíclicas de alimentos en la dinámica de los cultivos microbianos.
Tales investigaciones se realizaron con la mayoría de los organismos, que generalmente se aplican en la producción a gran escala, incluidos Penicillium chrysogenum, cepas de Streptomyces, levadura de panadería, Gluconobacter oxydans para la fermentación de ácido glucónico e incluso butanol. producción por Clostridium sp.
También se realizó un interesante estudio, mezcla y distribución espacial en biorreactores, sobre la degradación de la parafina por levaduras además de la desulfuración del carbón y el tratamiento de aguas residuales.
Todos los estudios de este período describen preferentemente perturbaciones de aireación o alimentación.
Sin embargo, las primeras ideas surgieron al utilizar reactores de flujo pistón o de bucle para separar las diferentes zonas en un sistema de biorreactor y estudiar la cinética de respuesta microbiana en detalle.
Además de Katinger, Gschwend et al. utilizaron un modelo de dos compartimentos de un biorreactor de circuito único (100 l torus) con un agitador integrado.
Se detectaron diferentes concentraciones de NADH mediante determinación de fluorescencia en línea a 460 nm en un cultivo de quimiostato continuo en las dos partes diferentes del reactor de escala reducida.
Por lo tanto, se demostró una respuesta fisiológica oscilatoria de la levadura estrictamente aeróbica Trichosporon cutaneum.
Otro sistema de circulación fue aplicado por Larson y Enfors, quienes utilizaron un reactor de tanque agitado con un circuito externo.
Su sistema fue más fácil de implementar en sistemas de biorreactor de laboratorio estándar.
Por lo tanto, se aplicó en estudios posteriores, sin embargo, con varias modificaciones.
Paralelamente a la pregunta de cómo los microorganismos responden a ciertas zonas en un biorreactor grande, surgió la pregunta de qué parámetros podrían probar tal respuesta.
Si bien la relación NAD+/NADH fue adecuada para seguir las respuestas a la limitación de oxígeno, se propuso que es probable que la zona de alimentación de los biorreactores a gran escala provoque actividades metabólicas altas y, en consecuencia, cause limitación de oxígeno.
Cleland y Enfors propusieron medir H2 como un metabolito anaeróbico además de la relación NAD+/NADH en cultivos de Escherichia coli.
Metodologías de escalado en biorreactores ascendente y descendente
Una metodología de escalado en biorreactores, ampliación y reducción, basada en el conocimiento es vital, independientemente del microorganismo o producto de destino, para la transferencia de un bioproceso desde el laboratorio a la escala de producción industrial.
En cualquier caso, la estimación de la sensibilidad de parámetros específicos sobre el rendimiento del proceso de escalado en biorreactores industrial es de fundamental interés.
Tal conocimiento del proceso tiene que considerar aspectos de la dinámica de fluidos con respecto al tipo específico de biorreactor aplicado y las respuestas del sistema biológico a los cambios en los parámetros del proceso físico y químico.
Un problema importante en el aumento de escala de los procesos por lotes alimentados es la formación de gradientes de concentración a altas densidades celulares.
Las condiciones heterogéneas evolucionan cerca de la adición de alimentación, la entrada de gas y cerca de la adición de cualquier agente de control, como una base o un ácido.
La aparición de gradientes se basa en la entrada de energía global y local en la fase gas-líquido del biorreactor.
Si bien un escalado eficiente y exitoso de un bioproceso es crucial para las consideraciones de tiempo de comercialización, también es importante un escalado sólido para la transferencia de un bioproceso de una instalación de producción a otra, especialmente si el tipo, tamaño u otro se modifican los parámetros de construcción del biorreactor.
Sin embargo, el escalado en biorreactores no se puede reducir a parámetros de ingeniería clásicos como la entrada de energía, la velocidad de la punta del agitador, la concentración de oxígeno disuelto o el coeficiente de transferencia de oxígeno, pero debe incluir las condiciones fisiológicas dentro de la celda y la dinámica espacio-temporal de los parámetros ambientales que determinan las respuestas específicas y las constantes de tiempo de respuesta (cinética) en el sistema biológico.
Esto es específico para cada caso y, por lo tanto, necesita estudios específicos de la fase fluida y las respuestas complejas de las células a las perturbaciones ambientales rápidas en condiciones de cultivo heterogéneas.
Si bien los primeros bioprocesos industriales solo se basaban en tecnologías por lotes, la estrategia del principio más común aplicado en la producción industrial, la tecnología de alimentación por lotes, se patentó en 1915 en relación con la producción de levadura de panadería.
Modelo Flujo Gas-Líquido en Tanques Agitados
El objetivo del estudio de Modelado Numérico de Flujo Gas-Líquido fue crear un modelo para el flujo de gas-líquido en un biorreactor de tanque agitado utilizando el modelo Euleriano de dos fluidos que es independiente de los datos empíricos, para predecir la retención de gas, el tamaño de las burbujas y los patrones de flujo en los reactores agitados por una turbina y un impulsor.
Se utilizó un enfoque Euleriano-Euleriano en el modelo Flujo Gas-Líquido para resolver las ecuaciones de gobierno para las fases gaseosa y líquida.
Se supuso que el término de intercambio de cantidad de movimiento de la interfaz era un efecto combinado de la fuerza de arrastre, la fuerza de masa añadida, la fuerza de sustentación y la fuerza de dispersión turbulenta.
Dado que la resistencia depende de la turbulencia en el modelo Flujo Gas-Líquido, se propuso la siguiente correlación:
donde US y UT son la velocidad real de deslizamiento y la velocidad terminal estancada, respectivamente; y τP y TL son el tiempo de relajación de la burbuja y la escala de tiempo turbulento, respectivamente.
Se aplicó el modelo estándar k–𝜀 para la turbulencia.
Se añadió un término adicional a la expresión de la viscosidad turbulenta para tener en cuenta la velocidad de deslizamiento de las burbujas.
La fase gaseosa también se consideró de naturaleza turbulenta.
En lugar de considerar la distribución completa del tamaño de la burbuja, lo que aumenta el uso de recursos informáticos, se utilizó el modelo para predecir el diámetro medio de la burbuja en el reactor en función de la densidad numérica de la burbuja.
El modelo se da de la siguiente manera:
donde 𝜑br, 𝜑co y 𝜑ph son las tasas de ruptura, coalescencia y cambio de fase, respectivamente.
Los autores del estudio del modelo Flujo Gas-Líquido modelaron la formación de la cavidad de gas ventilada cerca de las palas del impulsor, donde las burbujas de gas no se comportan como una fase dispersa.
Se hicieron modificaciones en las ecuaciones gobernantes para incorporar estas condiciones en el mismo marco Euleriano.
Las condiciones de operación se mantuvieron similares a las de las condiciones de operación experimentales.
Con la turbina, solo se modeló una sección de 60 ∘ del tanque, incluyendo un deflector y un álabe del impulsor, y se aplicó la condición de frontera periódica (la dinámica de flujo en esta sección del reactor se repitió en secciones posteriores).
Se utilizaron alrededor de 59 000 celdas para la simulación de esta sección.
Se utilizó un modelo de marco de referencia múltiple (MRF) para modelar un marco giratorio para la región del impulsor.
Para el impulsor Lightnin, era necesario simular el reactor completo debido al diseño del impulsor y, por lo tanto, se utilizaron 183 000 celdas.
El método MRF no dio resultados estables para el último impulsor y, por lo tanto, se utilizó el método de malla deslizante.
Se realizaron cuatro simulaciones diferentes con la turbina Rushton cambiando el caudal de entrada de gas y la velocidad de rotación del impulsor.
Se compararon los resultados obtenidos con el método estándar (como se menciona en el código CFX) y los modelos mejorados de dispersión turbulenta y arrastre sugeridos por los autores, y se vio que los modelos sugeridos por los autores produjeron resultados más cercanos a los resultados experimentales.
Se observa que las burbujas de gas se acumulan en la región debajo del impulsor.
Al aumentar el caudal, aumenta la acumulación.
Los autores también compararon modelos estándar y modificados, y se concluyó que los modelos estándar subestimaron los valores de fracción de volumen de gas, especialmente en la región superior.
Por lo tanto, los autores modelaron con éxito el flujo gas-líquido y mejoraron los modelos publicados anteriormente, mejorando así la capacidad predictiva del modelo.
Se creó un nuevo modelo para predecir el coeficiente de arrastre para tener en cuenta las interacciones entre la burbuja y el remolino.
Se utilizó un rango de condiciones de operación para la simulación del reactor.
Los resultados simulados estaban en buen acuerdo con los resultados experimentales de retención de gas, distribución del tamaño de burbuja y fracción de volumen de gas.
CFD está encontrando cada vez más aplicaciones en bioprocesamiento, particularmente en el modelado de distribución de flujo en biorreactores.
Se ha convertido en una potente herramienta que se puede utilizar de forma eficaz para comprender los efectos de varios parámetros en las respuestas de salida, reduciendo así la necesidad de realizar experimentos en los reactores a gran escala.
Es evidente que el conocimiento de la hidrodinámica puede ser de gran ayuda para los investigadores que buscan (i) mejorar el diseño del reactor, (ii) optimizar y escalar el proceso y/o (iii) intentar comprender interacciones entre los diversos parámetros de entrada significativos (como la velocidad de agitación, el caudal de gas).
Es probable que el futuro vea una adopción a gran escala de CFD entre los desarrolladores de procesos.
Predicción del coeficiente en biorractores de recipientes agitados.
Para la predicción del coeficiente en biorreactores de transferencia de masa de dos fases de recipiente agitado, los solucionadores comerciales son bastante eficientes para predecir la dinámica del flujo en la mayoría de los casos, pero usarlos para diseñar un biorreactor agitado con perfiles de flujo complejos dentro del reactor sigue siendo un gran desafío para los investigadores.
En un estudio de caso, los autores utilizaron CFD para visualizar el coeficiente de transferencia de masa en el reactor. Se utilizó computación paralela para una mejor utilización de los recursos.
El biorreactor agitado era un biorreactor BioFlo 110 de 3 l a escala de laboratorio con un volumen de trabajo de 2 l. Contenía un solo impulsor con tres palas inclinadas en un ángulo de 45 ∘.
La concentración de oxígeno se detectó mediante una sonda de oxígeno disuelto de membrana polarográfica.
Los autores compararon estimaciones experimentales y simuladas numéricamente del coeficiente de transferencia de masa general.
Una vez más, se utilizó el enfoque multifásico Euleriano-Euleriano.
Las ecuaciones de transporte de continuidad y cantidad de movimiento se resolvieron por separado para cada fase.
Se incluyó un término de intercambio de cantidad de movimiento interfacial en las ecuaciones de transporte de cantidad de movimiento para tener en cuenta la fuerza de arrastre.
Para calcular la turbulencia mediante el enfoque multifásico Euleriano-Euleriano en el reactor se utilizó un modelo k–𝜀 disperso, un modelo de dos ecuaciones.
La concentración de la fase secundaria fue muy baja, por lo que se utilizó un modelo disperso.
Se utilizó un modelo de balance de población para capturar el efecto combinado de la ruptura de burbujas y la coalescencia en el tanque.
De los varios enfoques numéricos que están disponibles para resolver el PBE, se utilizaron los métodos discretos de clases.
Se supuso que las burbujas tenían un tamaño discreto.
El volumen de la burbuja en enfoque multifásico Euleriano-Euleriano se dividió entre las dos clases de modo que el volumen total permaneciera igual y se conservara la masa total.
Los autores explicaron que la ruptura ocurre cuando un remolino que tiene un tamaño más pequeño que la burbuja choca con la burbuja, y se supuso que la ruptura era binaria y dependía de la frecuencia de colisión y la probabilidad de ruptura.
Se utilizó Gambit 2.0 para el diseño y mallado del bioreactor. Se utilizaron casi 0,483 millones de células para la simulación. La malla contenía celdas de varias formas, como tetraedro, hexaedro, cuña y pirámide. La asimetría de todas las celdas se mantuvo por debajo de 0,7 y se utilizó el solucionador fluent 6.2 para discretizar las ecuaciones y resolverlas numéricamente.
El dominio del reactor con el enfoque multifásico Euleriano-Euleriano se dividió automáticamente en varias particiones y cada partición se envió a un nodo computacional para obtener una solución.
Se consideraron diferentes números de nodos computacionales y se compararon los resultados.
Se observó que al aumentar el número de nodos aumentó la eficiencia, pero después de 16 nodos, la efectividad no cambió significativamente.
Por lo tanto, se utilizaron 16 nodos para simulaciones adicionales.
Se realizó computación paralela para las cuatro particiones automáticas del dominio del reactor.
Cada partición se envió a un nodo separado para su cálculo y los resultados se combinaron automáticamente.
Se tomó un número diferente de contenedores para la entrada al método de clases y se compararon los resultados.
Las cuatro clases de distribución de tamaño de burbuja, es decir, Clase 7, Clase 9, Clase 11 y Clase 13 con ecuación PBE contenían 7, 9, 11 y 13 números de contenedores, respectivamente, y cada uno con un rango de tamaño de burbuja de 0,75 a 12,00 .
Los autores observaron que al aumentar el número de contenedores y mantener constante el diámetro mínimo y máximo de la burbuja, la precisión del método numérico en la predicción del valor de kLa aumentó mientras que el tiempo computacional aumentó.
A partir de las gráficas de contorno del diámetro medio de Sauter, quedó claro que el tamaño de la burbuja aumentaba a medida que nos movíamos desde el fondo hasta la parte superior del reactor.
Las burbujas más pequeñas están presentes en la parte inferior mientras que las burbujas más grandes están presentes cerca de la región del impulsor.
Se encontró que esto estaba de acuerdo con las observaciones experimentales.
Se observa que los valores del coeficiente de transferencia de masa global simulado estaban cerca de los valores experimentales cuando se utilizó el modelo de balance de población.
Por lo tanto, los autores demostraron con éxito la necesidad de utilizar el modelo de balance de población al modelar la dispersión agitada en un reactor.
Las distribuciones de retención de gas, dispersión, diámetro medio de Sauter y coeficiente de transferencia de masa general se predijeron correctamente cuando se utilizó el modelo MRF a lo largo de PBE con diferentes clases de distribución de tamaño de burbuja.
Los resultados numéricos y experimentales se compararon y mostraron una buena concordancia para la distribución del tamaño de burbuja de 13 clases.
Aplicación de CFD en el modelado de biorreactores
Un caso de estudio en relación a CFD en el modelado de biorreactores , se utilizó una combinación única de diseño de experimentos (DOE) y CFD para definir un espacio de diseño con respecto a lograr un coeficiente de transferencia de masa (kLa) promediado por volumen objetivo.
En otro estudio de caso, se utilizaron herramientas CFD, como computación paralela y mallas adaptativas no estructuradas, para hacer un uso eficiente de la potencia computacional para calcular la retención de gas, el diámetro medio de la burbuja de Sauter, el coeficiente de transferencia de masa gas-líquido, y estructura de flujo utilizando el modelo MRF con balance de población.
Aquí, el modelo de múltiples marcos de referencia se ha utilizado para modelar la región del impulsor.
En un caso más de estudio, la capacidad predictiva del modelo se mejora al incluir explícitamente (i) la geometría del impulsor en el modelo, y (ii) el coeficiente de arrastre promedio (CD) de la fuerza interfacial en lugar de la correlación del coeficiente de arrastre estándar (basado en en ascenso a través de un líquido estancado).
El modelo resultante es significativamente mejor ya que la correlación del coeficiente de arrastre estándar no considera las continuas aceleraciones y desaceleraciones experimentadas por la burbuja debido a los remolinos turbulentos.
La mezcla óptima en el modelado de biorreactores es una necesidad para lograr una transferencia de masa eficiente de oxígeno a las células y mantener la uniformidad de la concentración de oxígeno y otros nutrientes en todo el reactor.
Sin embargo, el exceso de mezcla también puede dañar las células sensibles al cizallamiento.
La CFD se ha utilizado a menudo como herramienta para modelar la hidrodinámica local, la mezcla, la agitación y la transferencia de masa en el biorreactor.
El espacio de diseño se ha definido como “una combinación e interacción multidimensional de variables de entrada y parámetros de proceso que se ha demostrado que proporcionan garantía de calidad”.
En un estudio reciente, los autores utilizaron un enfoque multifásico euleriano-euleriano en el modelado de biorreactores en el sistema bifásico gas-líquido.
La ecuación de Navier-Stokes se resolvió para ambas fases, incluido el término de intercambio de impulso de interfase en cada ecuación.
Para la turbulencia, se utilizó un modelo estándar de dos ecuaciones k–𝜀.
El modelo de turbulencia se utilizó solo para la fase continua y la fase dispersa se trató como laminar.
Para la fase continua se resolvieron la energía cinética turbulenta “k” y la tasa de disipación de energía turbulenta “𝜀”.
Esta suposición se basó en el hecho de que la fracción de volumen de la fase secundaria es demasiado baja en comparación con la fase continua y, por lo tanto, la diferencia de densidad entre las dos fases es bastante alta.
Se incluyó un modelado de biorreactores de balance de población en forma discreta para tener en cuenta la coalescencia y la rotura de burbujas en el reactor.
Dado que en la forma discreta, se requiere como entrada la distribución del tamaño de la burbuja, se aplicó un método de prueba y error para estimar la distribución del tamaño de la burbuja para que los resultados simulados coincidan con los resultados experimentales.
A continuación, se modeló el coeficiente de transferencia de masa global en función de la velocidad del impulsor, el caudal de gas y el nivel de líquido en el reactor.
Se tuvo cuidado con la calidad de la malla de modo que el factor de asimetría para la mayoría de las celdas fuera inferior a 0,5 y la relación de aspecto estuviera entre 1 y 2.
Para la región cercana al impulsor, se usó un marco de referencia giratorio para resolver las ecuaciones de gobierno, mientras que para la región a granel se usó un marco de referencia estacionario.
Inicialmente, se realizó un estudio de independencia de la red para averiguar el número mínimo de celdas que se deben utilizar en las simulaciones.
Se encontró que se requería un mínimo de 0,838 millones de células.
Se realizaron simulaciones en el modelado de biorreactores para diferentes velocidades de rotación del impulsor y diferentes caudales de entrada de gas.
Como se esperaba, se encontró que el valor del coeficiente de transferencia de masa era máximo cerca de la región del impulsor, mientras que el valor disminuía a medida que uno se alejaba de la región del impulsor.
Esto está de acuerdo con el entendimiento general de que hay más turbulencia presente cerca del impulsor y, por lo tanto, es posible un contacto eficiente entre las fases en esta región.
También están presentes grandes remolinos, que aumentan la frecuencia de colisión en esta región.
Otra observación de las simulaciones fue el predominio de la coalescencia sobre la rotura en el reactor.
Se encontró que el diámetro promediado en volumen de los datos de distribución del tamaño de la burbuja era de 0,0036 m, que es más alto que el de la burbuja con un diámetro de 3 mm formada en el rociador.
Los datos kLa del coeficiente de transferencia de masa promediado en volumen se modelaron en función del nivel de líquido en el reactor, la velocidad de rotación del impulsor y el caudal de entrada de gas utilizando el software JMP.
Se obtuvo una expresión que muestra el efecto de estos parámetros en el valor de kLa de la siguiente manera:
- Diseño de experimentos y biorreactores (DoE)
- Comparación de métodos DoE para la optimización de la producción en biorreactores
- Evaluación del Diseño Experimental en biorreactores.
- Diseño de experimentos de cribado en biorreactores
- Diseño de experimentos de biorreactores para el desarrollo y optimización de medios .