Producción de proteínas recombinantes y estrategias de expresión.
El uso de sistemas de expresión inducibles (regulados) en la producción de proteínas recombinantes se ha señalado como una herramienta clave para minimizar la carga metabólica. Esto permite separar la fase de crecimiento (estado reprimido) de la fase de producción (estado inducido).
Es importante destacar que los procesos de alimentación por lotes de HCDC permiten tales esquemas de cultivo, incluida la optimización de parámetros como la tasa de crecimiento, el tiempo de inducción, la concentración de inductor, etc. Un principio aplicable genéricamente para minimizar el estrés causado por altos niveles de expresión de proteínas recombinantes es reducir la tasa de transcripción permitiendo así que la traducción y el plegamiento de proteínas recombinantes se desarrollen más lentamente.
Por ejemplo, esto se ha logrado en E. coli limitando la cantidad de inductor (por ejemplo, IPTG) suministrado al proceso o reduciendo la temperatura. Un nivel de inducción fisiológicamente tolerable permite un período de formación de producto prolongado y, por lo tanto, se puede obtener una mayor concentración específica de producto al final del proceso. En tales condiciones, se minimiza el estrés relacionado con el plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas durante la fase de inducción.
Se ha informado que las temperaturas de crecimiento reducidas aumentan la producción de proteínas recombinantes en varios organismos hospedadores, incluidas bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Los análisis proteómicos del efecto de la temperatura en cultivos de quimiostato de P. pastoris recombinante revelaron que el estrés de plegamiento generalmente disminuye a temperaturas de cultivo más bajas, lo que permite una secreción de proteínas heterólogas más eficiente.
Además, este estudio sugirió que la reducción de la demanda de plegamiento y degradación de proteínas también podría conducir a una menor demanda de energía. Además, la implementación de cultivos de P. pastoris en lotes de alimentación con temperatura limitada permitió reducir drásticamente los valores de muerte celular y la proteólisis de proteínas.
Además de la temperatura, las tasas de síntesis de proteínas también están moduladas por la tasa de crecimiento, por lo que se debe realizar un estudio cuidadoso de la relación entre la producción de proteínas recombinantes y la tasa de crecimiento específica.
En general, la selección de estrategias de cultivo que permitan prolongar la fase de producción y minimizar la inducción de respuestas al estrés es clave para obtener altos rendimientos de proteína recombinante.
Dado que el plegamiento y la secreción de proteínas se ven afectados por múltiples factores ambientales, incluida la temperatura, el pH, la osmolaridad y el estrés oxidativo, así como los parámetros de cultivo como la composición del medio, el tiempo de inducción, la concentración del inductor y la tasa de crecimiento, dicha selección puede llevar mucho tiempo.
La combinación de sistemas de microrreactores de alto rendimiento que se mencionan aquí, combinada con el monitoreo en línea de los marcadores de estrés, puede ofrecer una herramienta poderosa para el rápido desarrollo de estrategias de cultivo por lotes alimentados que minimizan el estrés y maximizan la producción de proteínas recombinantes.
Por ejemplo, las proteínas de fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) se han utilizado como indicadores para seleccionar estrategias de alta densidad celular de E. coli que minimizan el estrés (es decir, un mayor plegamiento de proteínas que da como resultado una señal de fluorescencia más alta), incluido el inductor de optimización (IPTG) concentración, punto de inducción, temperatura y composición del medio de crecimiento.
De manera similar, se ha informado de un enfoque basado en GFP fusionado a un promotor sensible al estrés para el monitoreo del estrés en línea en E. coli que también debería permitir una rápida selección de las condiciones óptimas de producción.
Consideraciones de diseño de biorreactores para minimizar el esfuerzo de corte.
Los efectos de la tensión causados por las fuerzas de cizallamiento debidas a la agitación mecánica en el reactor podrían requerir una atención especial. Esta es, en particular, la situación con las células de mamíferos cuando se cultivan en biorreactores de tanque agitado a gran escala. Estas células son muy sensibles al esfuerzo cortante. Esta propiedad impone una serie de limitaciones específicas sobre el diseño y el funcionamiento de los biorreactores de células animales, ya que está bien establecido que el cizallamiento puede dar como resultado la muerte celular o respuestas fisiológicas no letales.
Además, en el caso de celdas dependientes del anclaje, es necesario proporcionar un material de soporte con una relación de superficie grande, por lo que estas celdas generalmente se fijan en microportadores. Por lo tanto, la elección de las condiciones de agitación en este tipo de proceso tiene que mantener las células (o microvehículos) en suspensión completa y medio de cultivo homogeneizado, al tiempo que se limitan las restricciones mecánicas generadas por la hidrodinámica en las células.
También se han desarrollado biorreactores de membrana y métodos de microencapsulación para el cultivo celular simultáneo, la concentración de producto y la eliminación de subproductos tóxicos. Muchos de estos sistemas se comportan como sistemas de perfusión, donde las células se retienen en el reactor, el medio se agrega de forma continua o semicontinua y el medio gastado (que contiene metabolitos tóxicos) se elimina.
Las células de mamíferos en un biorreactor de tanque agitado están sujetas a esfuerzos cortantes o turbulencias dentro de la fase líquida, así como a fuerzas cortantes asociadas con la interfaz gas-líquido. El esfuerzo cortante asociado a líquidos puede resultar en muerte celular (necrosis), apoptosis celular y respuestas fisiológicas no letales. Este último puede afectar las funciones celulares, la fisiología, el contenido de superficie de los receptores celulares, los niveles de producción de proteínas recombinantes e inducir la apoptosis. Estos cambios pueden tener un impacto en la tasa de crecimiento, la productividad y la calidad del producto.
Para reducir el daño por cizallamiento a las células de mamíferos en el biorreactor, se han diseñado impulsores de bajo cizallamiento, como hidroalas de paletas anchas de bombeo hacia abajo o hacia arriba y impulsores de “oreja de elefante”. Además, en comparación con los procesos de fermentación microbiana, la entrada de energía normalmente recomendada para el cultivo celular es extremadamente baja.
La inmovilización en perlas de gel (alginato, colágeno, poliacrilamida), la microencapsulación de células de mamíferos y el uso de tales sistemas en una configuración de lecho fluidizado o empaquetado también pueden minimizar los efectos de cizallamiento en las células, así como mejorar la productividad. Se han implementado reactores basados en agitación inducida por olas con aireación en el espacio de cabeza, es decir, biorreactores de olas, para diferentes sistemas de células en volúmenes de reactor de hasta 200 l. En estos reactores, se ha informado que el esfuerzo cortante en condiciones de aireación es insignificante para el daño celular.
Las células en la interfaz gas-líquido son susceptibles de dañarse, ya que la rotura de las burbujas de aire es particularmente destructiva para las células que se acumulan en la interfaz de una burbuja de gas y el medio. Muchos agentes protectores de cizallamiento como Pluronic F-68 se utilizan comúnmente para evitar que las células se acumulen en la interfaz gas-líquido.
Otros aditivos como polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), celulosas derivatizadas (metocelas), dextranos, etc., también pueden minimizar el daño hidrodinámico de las células. Cuando se utilizan protectores de cizallamiento, el burbujeo de gas es el método más simple y aceptable para el intercambio de gases. No obstante, las líneas celulares difieren en la sensibilidad al cizallamiento. Por ejemplo, varias líneas celulares de importancia industrial, como las células CHO, ampliamente utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, son relativamente insensibles al daño celular.