Procesos de inoculación y estrategias de pasaje.

Debido a su sensibilidad a los pases basados en células individuales, lo que resulta en una pérdida celular esencialmente cuantitativa, las hPSC se pasaban tradicionalmente como colonias o grupos semidisociados en cultivo 2D y la inoculación de cultivos 3D inicialmente también se basó en esta estrategia. Dado que estos grupos de células tendían a adherirse entre sí dando como resultado una fusión extensa, particularmente en cultivos en suspensión estática, se ha sugerido la encapsulación en matrices para controlar este proceso. Las limitaciones de este enfoque incluyen la adición de matrices adicionales al proceso, el requisito de equipo especial y el control limitado sobre cuántas células o grupos quedarán atrapados en una sola cápsula. Otro problema es el estallido incontrolado de tales cápsulas, por ejemplo, en respuesta a la proliferación celular o al esfuerzo cortante en los biorreactores, lo que limita aún más el control y la reproducibilidad del método. Más recientemente, se informó que un polímero funcional denominado «goma de gelan» evita la fusión de los agregados en suspensión. Aunque el concepto subyacente es sólido, el método no admitía la siembra unicelular, sino que requería la interrupción mecánica de los agregados celulares mediante el procesamiento a través de un colador para la inoculación y el pase del proceso.

Por el contrario, el paso de células individuales permite, en principio, un proceso de inoculación completamente definido a una densidad celular preoptimizada. Por lo tanto, la estrategia apoya el control experimental en ciencia básica y facilita sustancialmente el desarrollo de procedimientos operativos estándar (POE) requeridos para los procesos que cumplen con las BPM. La otra ventaja de los pases basados en células individuales es la disociación completa de colonias (2D) y agregados (de 3D) en cada paso de expansión, lo que interrumpe la interacción intercelular prolongada en el núcleo de las respectivas colonias o agregados. La disociación completa interrumpe los contactos establecidos célula-célula, contrarrestando la formación de gradientes locales y el desarrollo de heterogeneidad de cultivo no deseada, lo que potencialmente desencadena una diferenciación incontrolada.

Sin embargo, el prerrequisito para el paso de hPSCs basado en células individuales era el desarrollo de medios de cultivo avanzados y particularmente la suplementación del compuesto químico Y-27632, un potente inhibidor de la quinasa asociado a Rho, que parece apoyar transitoriamente la vitalidad de hPSCs individuales, creando una ventana para la reagregación de hPSC después de la siembra.

Microportadores ocultivos de suspensión sin matriz: Pro y Contra

Una estrategia exitosa para la transición de hPSC a cultivo en suspensión es el uso de microportadores (MC). Se trata de partículas fabricadas a partir de diferentes materiales disponibles en diferentes formas y tamaños, que pueden utilizarse con nuestro sin recubrimiento de matriz adicional. Los MC se introdujeron en el bioprocesamiento para proporcionar células dependientes del anclaje, que son difíciles de adaptar al cultivo en suspensión, con una «superficie flotante» para la unión y, en paralelo, para elevar ampliamente el área de superficie tras la transición a 3D. La expansión de hPSCs sobre MC se ha demostrado con éxito en placas de cultivo estáticas seguidas de condiciones de agitación que incluyen matraces giratorios y biorreactores de tanque agitados instrumentados. A pesar de este éxito, los investigadores han observado la tendencia de las hPSC a adherirse entre sí (en lugar de a los tipos de microportadores preseleccionados), lo que induce un nivel adicional de heterogeneidad de cultivos. Los tipos de MC rígidos también podrían aumentar la tensión de cizallamiento, particularmente en condiciones de agitación, y se observó una fase de retraso extensa en la transición de hPSC a MC en biorreactores. El enfoque también requiere la eliminación potencialmente engorrosa de microportadores de preparaciones de células de grado clínico antes de las aplicaciones clínicas.

Utilizando el producto químico ROCKi en combinación con la disociación enzimática en células individuales para una inoculación más estandarizada, nosotros y otros hemos demostrado la expansión de hPSC indiferenciadas como agregados de células libres de matriz en suspensión estática y en matraces giratorios agitados. En estos estudios de prueba de concepto, se demostró el mantenimiento de la pluripotencia y la estabilidad del cariotipo en numerosos pasajes (es decir, ciclos repetidos de disociación y reagregación agregadas). Posteriormente, se llevó a cabo la transferencia a biorreactores instrumentados de tanque agitado a escala de 100 ml (sistema de reactor DASGIP paralelo, Julich, Alemania) incluyendo la optimización inicial de las densidades de inoculación celular y las condiciones de agitación (como el diseño del impulsor y la velocidad de agitación). Los parámetros clave del proceso, incluida la cinética de crecimiento, el pH, el OD y la concentración de lactato, se controlaron durante los 7 días de duración del proceso.

En comparación con el cultivo en suspensión en placas de plástico, donde las células están más concentradas en el fondo de la placa debido a la gravedad (en lugar de estar distribuidas homogéneamente en 3D completo), inoculadas a ~ 0.5-1 × 105 cellml − 1 aproximadamente cinco a Se requirió una siembra de células diez veces mayor a ~ 5 x 105 células ml-1 para la formación exitosa de agregados en reactores con agitación de impulsor. Posteriormente se consiguieron densidades de recogida de células de aproximadamente 2 x 106 células ml-1 correspondientes a una expansión de tres a seis veces por pase en condiciones de agitación. Por tanto, a pesar del éxito general del método, estos datos solicitan una optimización sustancial del proceso con respecto al rendimiento celular por mililitro de medio y también al rendimiento global del proceso.