Enfoques indirectos para monitorear el crecimiento en biorreactores
En esta ocasión se mencionan brevemente algunos de los enfoques directos y diversos enfoques indirectos que pueden utilizarse para supervisar el crecimiento de los sistemas de SSF. No pretende ser una revisión exhaustiva y no proporciona protocolos para los diversos métodos. Estos deben ser buscados en referencias originales.
En algunos casos es posible la separación directa de la biomasa. Con organismos unicelulares puede ser posible desalojar las células de las partículas sólidas durante una etapa de homogeneización y después separar los sólidos de las células suspendidas por sedimentación. Sin embargo, algunas células permanecerán adheridas a los sólidos sedimentados mientras que algunas partículas finas sólidas («finas») liberadas de los sólidos no sedimentarán. Estos finos causarán problemas para la determinación del peso seco por filtración del sobrenadante, ya que se contarán erróneamente como biomasa seca. Si se realizan mediciones de recuento viables en el sobrenadante, es muy probable que los finos tengan varias células adsorbidas sobre ellas, y éstas darán lugar a una sola colonia por partícula en lugar de una colonia por célula.
En fermentaciones fúngicas, a veces es posible digerir el sustrato sólido dentro de una solución enzimática acuosa, permitiendo así que la biomasa micelial sea recuperada por filtración. Por ejemplo, esto puede ser posible si el sustrato sólido se basa en almidón y contiene poca fibra, en cuyo caso el sustrato se puede hidrolizar con amilasas. Sin embargo, parte del peso seco de la biomasa puede perderse en este procedimiento y algunos residuos sólidos pueden permanecer en la fracción de biomasa filtrada. La eficacia de la recuperación se pudo comprobar sometiendo masas conocidas de micelio fúngico, por ejemplo, del cultivo de filtro de membrana, al procedimiento de hidrólisis y recuperación.
Varios métodos indirectos se basan en la medición de componentes de biomasa como:
Ergoesterol. Este es el esterol predominante en la membrana celular de muchos hongos, y típicamente no se encuentra en el material vegetal. Se puede medir cuantitativamente mediante cromatografía de gases, HPLC, o espectrometría UV.
Glucosamina. Esto se produce por la hidrólisis de la quitina, que muchos hongos contienen en su pared celular. Normalmente no se encuentra en materiales de origen vegetal. La hidrólisis de la biomasa y la posterior determinación de la glucosamina por el método químico puede ser bastante tediosa. Puede ser preferible determinar la glucosamina en el hidrolizado por HPLC.
Proteína. La proteína es un componente celular importante. Sin embargo, está presente en muchos materiales vegetales y, si está presente, será imposible conocer la proporción de proteína en la muestra que proviene del sustrato y la proporción que proviene de la biomasa, ya que el microorganismo típicamente hidrolizará la proteína durante el crecimiento. Por lo tanto, el uso de la determinación de proteínas como indicador de crecimiento se limita a casos en los que el sustrato contiene una proteína insignificante.
Desafortunadamente, el contenido de todos estos componentes dentro de la biomasa puede variar con las condiciones de cultivo y con la edad del micelio fúngico. Esto complica enormemente la conversión de las mediciones indirectas en estimaciones del peso seco de la biomasa.
Otros métodos indirectos se basan en la detección de actividades de la biomasa. De éstos, el consumo de O2 y la producción de CO2 son los más importantes. El metabolismo del gas es potencialmente una actividad de crecimiento muy importante, especialmente porque la tasa de evolución del calor típicamente será directamente proporcional a la tasa de consumo de O2, al menos para un proceso aeróbico. Además, el consumo global de O2 en un biorreactor puede utilizarse para la monitorización en línea del proceso de crecimiento, aunque no es necesariamente una cuestión simple convertir el perfil de consumo de O2 en un perfil de crecimiento de biomasa digno de confianza. Debido a la importancia de las mediciones de captación de O2, el uso experimental de este método en estudios cinéticos de crecimiento lo discutiremos en otra ocasión.
La discusión anterior muestra que varias preguntas deben ser contestadas al seleccionar un método indirecto apropiado para estimar el crecimiento:
¿El componente que se va a medir también está presente en el sustrato?
¿Qué tiempo y recursos se requieren para procesar las muestras?
¿Hasta qué punto la relación entre la actividad o componente y la cantidad de biomasa presente cambia durante la fermentación? Puede o no ser deseable convertir una medición indirecta en una estimación de la propia biomasa. Si se desea hacerlo, entonces el método de medición debe ser calibrado. En otras palabras, el organismo debe crecer en un sistema que permita medir el peso seco de la biomasa además del componente o actividad.